RNA甲醛变性电泳实验原理和操作

[原理] 用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA分子大许多，电泳迁移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%~85%，tRNA及核内小分子RNA占15%~20%，mRNA占1%~5%。故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见的23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA构成的条带。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不见的。故可通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果。

[试剂]

1. 琼脂糖

2. 0.1%DEPC处理的水

3. 10×电泳缓冲液

MOPS（吗啡代丙烷磺酸）0.2mol/L

EDTA 0.01mol/L

NaAc 0.05mol/L

用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，临用时用DEPC水稀释。

4. 上样缓冲液

0.5ml甲酰胺（100%）

0.2ml甲醛（37%）

0.1ml 10×电泳缓冲液

0.06ml溴酚兰（饱和溶液）
易生物仪器库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

[仪器]

1.电泳仪

2.电泳槽

3.移液嘴

4.烧杯

5.微量离心管

以上器皿均分别用去污剂溶液、自来水、双蒸水冲洗，然后用乙醇干燥，DEPC处理的水彻底冲洗。

[操作]

1. 电泳胶（50ml）制备 称0.55克琼脂糖加36mlDEPC处理过水，加热溶解琼脂糖，冷却至60℃，加3μl溴乙锭（1g/L）、9ml 甲醛（37%）和5ml 10×电泳缓冲液，然后灌制凝胶，于室温放置30分钟以上使凝胶凝固。

2. RNA样品处理 在一灭菌的微量离心管中加入2μl RNA 样品（约4μg），加5μl上样缓冲液，至60℃水浴15分钟使RNA变性，再冰浴。

3. 电泳 将样品加入加样孔，3~4V/cm电泳，当溴酚兰移动到胶的3/4处停止电泳。

4. 观察结果 紫外灯下可见28S、18S和5S rRNA三条带，观察28S和18S二条带是否清晰，若28S的荧光强度为18S的二倍以上，则说明RNA分子没有降解。