PCR扩增产物的电泳分析-1

凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。
一、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物。根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等。
1、凝胶浓度
凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定。

琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围

 

琼脂糖浓度(%)	线型DNA分子的分离范围(Kb)
0.3	5～60
0.6	1～20
0.7	0.8～10
0.9	0.5～7
1.2	0.9～6
1.5	0.2～3
12.0	0.1～2

2、电泳缓冲液

核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE)。TBE 与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀。TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用 TBE.缓冲液中的EDTA可螯合 二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解。
10XTBE缓冲液的配制：Tris硷，108克 EDTA，9.3克 硼酸，55克 H2O至，1000ul (其PH应为8.0～8.2) 临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释。
3、核酸电泳的指示剂与染色剂
1）指示剂：核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色。
溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。
二甲苯青的水溶液呈兰色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用有①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。