SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量（垂直板型电泳）-2

三、器材与试剂：
1．器材：
①夹心式垂直板电泳槽，凝胶模（135×100×1.5mm）（北京六一仪器厂）
②直流稳压电源（电压300—600V，电流50—100mA）
③吸量管（1,5,10 ml） ④烧杯（25,50,100 ml）
⑤ 细长头的滴管 ⑥1ml注射器及6号长针头
⑦微量注射器（10μl或 50μl） ⑧水泵或油泵
⑨真空干燥器 ⑩培养皿（直径120mm）
2．试剂：
（1）标准蛋白质
目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于 SDS-PAGE测定未知蛋白质分子量。
①高分子量标准蛋白试剂盒（Pharmacia公司产品，表中16-1）。

表16-1 5种标准蛋白质

蛋白质名称	Mr	来源
甲状腺球蛋白 铁蛋白 过氧化氢酶 乳酸 脱氢酶 血清清蛋白	669 000 440 000 232 000 140 000 67 000	猪甲状腺 马肺 牛肝 牛心 牛 血 清

同时按说明书要求处理
②低分子量标准蛋白试剂盒，中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂生产（表16-2）。
表16-2 5种标准蛋白质

蛋白质名称	Mr
磷酸化酶B 牛 血清蛋白 肌动蛋白 磷酸酐酶 烟草花叶病毒外壳蛋白	94 000 67 000 43 000 30 000 17 500

每种蛋白含量为40μg。用时加入200μl样品溶解，经处理后，上样10μl（2μg）就能显示出清晰的条带。

③自己配制低分子量或高分子量标准蛋白质混合试剂。如买不到标准蛋白试剂盒时，可参考常用的标准蛋白质及其分子量表。从中选择3—5种蛋白质，如马心Mr35 000）、鸡卵卵清蛋白（Mr43 000）、牛血清白蛋白（Mr67 000）等蛋白质，按照每种蛋白0.5—1mg·ml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。
（2）连续体系SDS- PAGE有关试剂
①0.2mol·L-1pH7.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠(AR)Na₂HPO₄·2H₂O25.63g 或Na₂HPO₄·12H₂O51.58g，再称取磷酸二氢钠(AR)NaH₂PO₄·H₂O7.73g 或NaH₂PO₄·2H₂O8.74g，溶于重蒸水中并定容到1000ml。
② 样品溶解液：0.01mol·L-1pH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS、1%巯基乙醇、10%甘油或40%蔗糖及0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测固体蛋白质样品。配制方法如表16-3。

表16-3连续体系样品溶解液配制

 

 

SDS	巯基乙醇	甘油	溴酚蓝	0.2mol·L-1磷酸盐缓冲液	加重蒸水至最后总体积为
100mg	0.1ml	1ml	2mg	0.5ml	10ml

如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。
③凝胶贮液：称Acr 30g,Bis 0.8g，加重蒸水至100ml，过滤后置棕色瓶，4℃贮存可用1—2个月。
④凝胶缓冲液：称SDS 0.2g，加0.2mol·L^-1 pH7.2磷酸盐缓冲液至100ml。4℃贮存，用前，稍加温使SDS溶解。