聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定IgG纯度-3

4．加样
作为分析用的PAGE加样量仅需几微克，2-3ul血清电泳后就能分出几十条蛋白区带。为防止样品扩散，应在样品中加入等体积40%蔗糖（内含少许溴酚兰）。用微量注射器取5ul上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。
5．电泳
将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接（方向切勿接错）。接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时将电流调至 10 mA 。待样品进入分离胶时将电流调至20-30mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘1cm时，将电流调回到零，关电源及冷却水。分别收集上、下贮槽电极缓冲液置试剂瓶中，4℃贮存还可用1-2次。旋松固定螺丝，取出硅橡胶框，用不锈钢铲轻轻将一块玻璃板撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
6．固定，染色
本实验采用0.05%考马斯亮蓝R250（内含20%磺基水杨酸）染色液，染色与固定同时进行，使染色液没过胶板，染色30min左右。
7．脱色
用7%乙酸侵泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去。如用50℃水浴或褪色摇床，则可缩短褪色时间。脱色液经活性碳脱色后，可反复使用。

（四）注意事项
1．制备凝胶应选用高纯度得试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。Acr及Bis是制备凝胶得关键试剂，如含有丙烯酸或其它杂质，则造成凝胶聚合时间延长，聚合不均匀或不聚合，应将它们分别纯化后方能使用。Acr及Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，实验表明对小鼠得半致死量为170mg/kg，操作应在通风中进行。 Acr的纯化：称70gArc溶于1000ml 50℃预热的氯仿中，溶解后趁热过滤。冷却后，置-20℃低温冰箱中，则有白色结晶析出，用预冷的布氏漏斗抽滤，收集白色结晶，再用预冷的氯仿淋洗几次，真空干燥后置棕色瓶中密封储存。Acr的熔点为84.5+0.3。纯Acr水溶液pH应是，其pH值变化不大于0.4pH单位就能使用。Bis的纯化：称12gBis，使其溶于1000ml预热40-50℃ 的丙酮中，趁热过滤。冷却后，置 -20℃ 低温冰箱中，待结晶析出后，用预冷的布氏漏斗抽滤，收集结晶，用预冷丙酮洗涤数次，真空干燥后置棕色瓶阿訇密封保存，Bis熔点为185℃。 Acr和Bis的储液在保存过程中，由于水解作用而形成丙烯酸和NH3，虽然溶液放在棕色试剂瓶中，4℃储存能部分防止水解，但也只能储存1-2个月，可测pH值（4.9-5.2）来检查试剂是否失效。

2．由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥交时凝胶板易断裂，为防止次现象，所以器材应严格地清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板及电泳槽用泡抹海绵蘸取“洗洁净”仔细清洗。玻璃板侵泡在重铬酸钾洗液3-4h或0.2mol/LKOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗净，再用泡沫海绵蘸取“洗洁净”反复刷洗，最后用蒸馏水冲洗，直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。

3．安装电泳槽和镶有长、短玻璃的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋转紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽模板梳齿应平整光滑。
4．用琼脂（糖）封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。
5．凝胶完全聚合后，必须放置30min-1h，使其充分“老化”后，才能轻轻取出样品槽模板，切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳区带扭曲。
6．为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品槽可用透析法或凝胶过滤法脱盐。最大加样量不得超过100ug蛋白/100ul。
7．在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶聚合后进行，洗净胶面后才能制备脓缩胶。浓缩胶制备后， 不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。
8．电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压、过高或过低均可影响电泳效果。
9．电泳后，应分别收集上下储槽电极缓冲液，在冰箱储存，可用2-3次。为保证电泳结果满意，最好用新稀释的缓冲液。