SSR及PAGE电泳-1

相关知识

SSR简介

所有真核生物基因组中都有一类叫微卫星（microsatellite）或简单序列重复（simple sequence repeats）的序列，它是由2-5个核苷酸首尾相连重复多次构成的一段DNA序列，具有很强的保守性。可以根据这段序列两边的序列设计引物，用PCR方法扩增出中间的SSR序列。

在设计引物的时候，遵循的原则与一般PCR引物的设计相同，每条引物一般为18-24个核苷酸，（G+C）%含量接近50 %（Tm为55℃左右），避免引物内二级结构的产生及某个核苷酸的连续出现，3'末端最好富含GA，PCR扩增产物在100-300 bp之间。

由于SSR扩增为特异性扩增，相对来说，重现性和稳定性都较好，但由于每对引物（G+C）含量不同，扩增产物长度不同，所以有必要给每对引物一个合适的扩增条件，这一般可通过改变反应液中Mg2+的浓度、反应的退火温度、延伸时间和循环指数来获得清晰且重复性好的条带。SSR扩增片段小（一般在300 bp以下，不同材料间差异小（一般为几个bp），故通常使用聚丙烯酰胺电泳。

由于简单序列的重复次数在同一物种的不同基因型间差异很大，因此SSR是一种多态性很高的分子标记。　

聚丙烯酰胺凝胶电泳

丙烯酰胺是一个单体，其结构为：

通常由过硫酸胺提供并可被TEMED（N, N, N', N'-四甲基乙二胺）所稳定的自由基可以引发一个链式反应，使丙烯酰胺单体合成长链。双功能基团N, N'-亚甲双丙烯酰胺参与聚合反应时，链与链之间交联成凝胶。其孔径由链长和交联度所决定。链长由聚合反应中丙烯酰胺的浓度（3.5-20%）所决定：每29个丙烯酰胺单体可形成1分子的交联体。

聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶费事。聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开并封以绝缘物，在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：1）分辨率很强，长度仅仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开；2）所能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶：多达10μg的DNA可以加样聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽而不致显著影响分辨力；3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求最高的实验。
主要试剂
1、SSR引物（从公司购得）
2、10×PCR Buffer、25 mM MgCl2、2.5 mM dNTP、Taq DNA聚合酶（5U/μL）、dd H2O
Taq DNA聚合酶购自TaKaRa，其余试剂附送。
3、40%丙烯酰胺（100mL）： 38g丙烯酰胺
2g N, N'-亚甲双丙烯酰胺
加dd.H2O定容，37℃搅拌溶解，室温避光保存。
4、过硫酸胺10% (10mL)： 1g过硫酸胺溶于10 mLdd.H2O中，4℃保存。
5、5×TBE（1000mL）： 54g Tris碱，27.5g硼酸，20mL 0.5mol/L EDTA (pH8.0)
6、6×上样缓冲液（100mL）： 2.5g溴酚蓝
2.5g二甲苯青FF
40g蔗糖
加dd.H2O定容，37℃搅拌溶解。4℃保存。
7、琼脂糖
8、EB染色液

实验步骤

一、SSR扩增

1、模板稀释

取2μL定好量的DNA原液，加入38 μL dd H2O，轻轻吸打混匀。