Rt-PCR实验准备及与操作步骤-3

注：
1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解
2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月（甚至可一年以上）
3、RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年

两步法RT-PCR
（第一步：逆转录反应）
试剂 浓度 体积 终浓度
RNA 23μl(11.5μl)
Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl
（稀释10倍后用）
↓
混匀，离心，70℃ 5min
↓
立即冰水浴，稍离心
↓
试剂 浓度 体积 终浓度
M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1×
dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM
RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ
M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U
总体积40μl（20μl）
↓
混匀，离心，42℃ 60min
↓
95℃ 10min（破坏MLV）
↓
4℃保存
两步法RT-PCR
（第二步：PCR反应）
总体积20μl(50μl)
试剂 浓度 体积 终浓度
Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1×
MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM
dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM
上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
cDNA 模板 X (?) (1-10μl)
DEPC水 20μl-4.3μl-X
Taq酶 2.5U/μl 0.3μl (1μl) 2.5U/μl
↓
混匀
↓
97℃，5分钟
↓
立即冰水浴
↓
混匀
↓
95℃ 5分 预变性
94℃ 30秒 变性
X℃ 40秒 退火
72℃ 30秒 延伸
72℃ 7分 终末延伸
28-36循环，4℃保温
三、电泳：
加1-10μl PCR产物+溴芬兰（1-2.5μl）混匀，加样，电泳。
注意：Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存，操作时置于冰上。DNTP勿反复冻融。