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RT-PCR实验原理与步骤

作者：中华医学网发布时间：2017-10-14 20:06浏览：次

【实验原理】
RT-PCR 是以RNA 为模板经逆转录反应（Reverse Transcription，RT）产生cDNA 第一链，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。
【实验仪器】
1. 恒温金属浴
2. PCR 扩增仪
【试剂及配制】
RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0
试剂包括：
1. AMV 反转录酶XL (5 U/ul)
2. 10×反转录反应缓冲液
3. RNAase 抑制剂(40 U/ul)
4. 随机引物9 mers (50 pmol/ul)
5. RNAase Free dH2O
6. TaKaRa Ex TaqTM HS (5 U/ul)
7. 5×PCR 反应缓冲液
8. dNTP Mixture (各10 mM)
【实验步骤】
1. 反转录反应
1）按下列组成配制反转录反应液
MgCl2 2ul

2. PCR 反应
1）按下列组成配制PCR 反应液

2）把此反应液加入到第一阶段反转录结束后的PCR 反应管中，轻轻混匀；
3）按以下条件进行PCR 反应：94 ℃ 2 min，94℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72℃ 4 min、30 cycles，72℃ 5 min。
4）琼脂糖凝胶电泳检测结果。
【注意事项】
1. PCR 条件设定
退火温度可根据实际情况适当地提高或降低（50℃～60℃）。延伸时间因目的序列长度不同而不同。cDNA 量较少时，循环次数可增加为40～50 次。
2. 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix），然后再分装到每个反应管中。
3. 使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取前要小心地离心搜集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
4. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回－20℃中保存。
5. 分装试剂时务必使用新的Tip 头，防止样品间污染。
6. 最佳的PCR 条件，因PCR 扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先试做一下Control 反应，以确定最佳的PCR 条件。