RT-PCR原理与实验操作步骤-3

八、PCR产物电泳

先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。

九、几个注意点：

1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？

2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。

3、RNA抽提前，打开离心机预冷。

TRIzol法抽提总RNA

细胞1×107

组织100mg

↓

加1mlTRIzol

细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块

↓

匀浆（要彻底，后转至EP管）

（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）

↓

颠倒混匀10下，室温5分钟

↓

加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）

↓

颠倒混匀10下，室温5分钟

↓

4℃，离心12000g，15分钟

↓

转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中

↓

加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟

↓

4℃，离心12000g，10分钟

↓

弃上清

↓

加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml

↓

4℃离心7500g，5分钟

↓

弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）

↓

溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）

（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）

注：

1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解

2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月（甚至可一年以上）

3、RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年

两步法RT-PCR

（第一步：逆转录反应）

试剂 浓度 体积 终浓度

RNA 23μl(11.5μl)

Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl

（稀释10倍后用）

↓

混匀，离心，70℃ 5min

↓

立即冰水浴，稍离心

↓

试剂 浓度 体积 终浓度

M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1×

dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM

RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ

M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U

总体积40μl（20μl）

↓

混匀，离心，42℃ 60min

↓

95℃ 10min（破坏MLV）

↓

4℃保存

两步法RT-PCR

（第二步：PCR反应）

总体积20μl(50μl)

试剂 浓度 体积 终浓度

Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1×

MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM

dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM

上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol

下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol

cDNA模板 X (?) (1-10μl)

DEPC水 20μl-4.3μl-X