一、目的要求
掌握观察霉菌形态的基本方法,并观察其形态特征。
二、基本原理
霉菌可产生复什分枝的菌丝体,分基内菌丝和气生菌丝,气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝,由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多(约为3-10μm),常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍,因此,用低倍显微镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法,常用的有下列三种:
直接制片观察法: 是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中,制成霉菌制片镜检。此染色液制成的霉菌标本片其特点是:(a)细胞不变形;(b)具有杀菌防腐作用,且不易干燥,能保持较长时间;(c)溶液本身呈蓝色,有一定染色效果。
载玻片培养观察法:此法是接种霉菌孢子于载玻片上的适宜培养基上,培养后用显微镜观察。这种方法可观察霉菌自然生长状态下的形态。
玻璃纸培养观察法:为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态还可利用玻璃纸透析培养法进行观察。此法是利用玻璃纸的半透膜特性及透光性,将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上,然后将长菌的玻璃纸剪取一小片,贴放在载玻片上用显微镜观察。
三、器材
曲霉(Aspergillus sp.),青霉(Penicillium sp.),
根霉(Rhizopus sp.),乳酸石炭酸棉蓝染色液,查氏培养基平板,
马铃薯培养基;无菌吸管,载玻片,盖玻片,解剖针,镊子,滤纸等。
四、操作步骤
1.一般观察法
于洁净载玻片上,滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液,用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中,再细心地将菌丝挑散开,然后小心地盖上盖玻片,注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察,必要时再换高倍镜。
2.载玻片观察法
(1)将略小于培养皿底内径的滤纸放入皿内,再放上U形玻棒,其上放一洁净的载玻片,然后将二个盖玻片分别斜立在载玻片的两端,盖上皿盖,把数套(根据需要而定)如此装置的培养皿叠起,包扎好,用1.05kg/cm2,121.3℃灭菌20分钟或干热灭菌,备用。
(2)将6―7ml灭菌的马铃薯葡萄糖培养基倒入直径为9cm的灭菌平皿中,待凝固后,用无菌解剖刀切成0.5―1cm2的琼脂块,用刀尖铲起琼脂块放在已灭菌的培养皿内的载玻片上,每片上放置2块。
(3)用灭菌的尖细接种针或装有柄的缝衣针,取(肉眼方能看见的)一点霉菌孢子,轻轻点在琼脂块的边缘上,用无菌镊子夹着立在载玻片旁的盖玻片盖在琼脂块上,再盖上皿盖。
(4)在培养皿的滤纸上,加无菌的20%甘油数毫升,至滤纸湿润即可停加。将培养皿置28℃培养一定时间后,取出载玻片置显微镜下观察。