细菌的简单染色(Simple stain)与革兰氏染色(Gram stain)

一、目的要求
1、学习细菌染色的原理和方法；
2、掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
二、基本原理
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
细菌经结晶紫初染染成蓝色。革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。

三、实验器材
1、菌种
培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）
2、染色液和试剂
结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、复红、二甲苯、香柏油
3、器材
废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜
四、实验方法及步骤
1、简单染色
（1）涂片 取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取
干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。
（2）晾干 让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干；
（3）固定 手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）；
（4）染色 将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min；
（5）水洗 用水洗去涂片上的染色液；
（6）干燥 将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干；

（7）镜检 先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。
2、革兰氏染色
（1）涂片 与简单染色涂片相同；
（2）晾干 与简单染色法相同；
（3）固定 与简单染色法相同；
（4）结晶紫色染色 将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟；
（5）水洗 倾去染色液，用水小心地冲洗；
（6）媒染 滴加卢哥氏碘液，媒染1min；
（7）水洗 用水洗去碘液；
（8）脱色 将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗；
（9）复染 滴加蕃红复染5min；
（10）水洗 用水洗去涂片上的蕃红染色液；
（11）晾干 将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干；
（12）镜检 镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性；
五 注意事项
1、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定，需要多加练习；
2、选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应.