植物总RNA的提取规程

一、实验目的
掌握植物总RNA提取的原理和方法
二、实验原理
RNA的提取：破坏细胞膜—除去蛋白—除去DNA—除去盐离子。
RNase是一类生物活性极其稳定的酶类，能耐高温、耐酸、耐碱，高压灭菌处理也不能使其完全失活。在提取RNA实验中，要尽量抑制RNase的活性。
•DEPC（焦磷酸二乙酯）是很强的RNase抑制剂，可以使RNase的活性丧失。实验中使用的 枪头、 EP管、溶液都要利用0.1%的DEPC处理，Tris不可以用DEPC处理。耐高温的玻璃器皿等要在250℃烘烤4小时以上。
•内源的 RNase一般利用蛋白质变性剂除去。如苯酚、氯仿、胍、SDS、十二烷基肌氨酸钠等。
无水乙醇、高浓度的盐溶液和异丙醇中可以沉淀RNA或 DNA，前两者利于沉淀大片段的核酸。

注意：DEPC是一种具有致癌嫌疑的有机物！相关操作要在通风橱中完成。 另外DEPC对单链的 DNA或RNA具有破坏作用，利用DEPC处理过的溶液和物品都要经过高温灭活处理后才可以使用（DEPC会分解成水和CO2 ） 。所有沾染DEPC的液体或物品在使用、遗弃前要高温灭活处理。
RNA操作的整个相关实验过程应该在超净台上完成, 操作者应配带口罩、帽子和手套。
三、实验材料、器具及药品
小麦叶片。
高速离心机、研钵、药匙、滤纸、冰盒、口罩、 手套、EP管架、超净工作台、移液器、枪头等。 预冷的乙醇和70%乙醇、液氮、RNA提取试剂盒等。

四、实验步骤
1.打开超净工作台和紫外灯，用乙醇烧研钵、药匙。
2.样品的裂解:液氮中将组织捣成粉末，液氮挥发后加 1 ml A液，立即用移液器抽打均匀。-20℃冰上静置10min，

加200µl B液，用力颠倒混匀（20余次），冰上静置10min，室温离心12000rpm，10min。
3.小心将上层水相移到另一个离心管中，加等体积 B液，颠倒混匀（20余次），冰上静置10min，室温离心12000rpm，10min。
4.再小心将上层水相移到另一个离心管中，加等体积 C 液，颠倒混匀，冰上静置30min，室温离心12000rpm，10min。
 
5. 弃去上层水相，加400µl E液和40µl D液，混匀后55℃水浴5-10min，中间摇动一次。
6. 将上清移到另一个离心管中，加1ml预冷的乙醇，颠倒混匀，冰上静置30min，室温离心12000rpm，10min。
7.弃去上层水相，加 1ml预冷的70%乙醇,转动清洗后倒掉乙醇，在超净工作台上吹干。
8.加20µl E液溶解RNA，4℃保存备用。