蛋白质印迹与探测(Western Blot)实验原理、方法与步骤（1）

【实验原理】

Western Blot（蛋白质印迹或免疫印迹）技术，以蛋白质为检测对象，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将样品蛋白质分离，再转移到固相载体（PVDF尼龙膜或NC膜）上；固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变；然后以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体（一抗）发生免疫反应，特异性一抗再与和酶耦联的第二抗体反应，最后在酶的作用下，导致底物显色或化学发光显影，来检测电泳分离的特异性目的靶蛋白。

蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异性高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测。

【实验对象】

待测蛋白质或基因表达产物。

【试剂与器材】

1.SDS-PAGE试剂(见SDS-PAGEelectrophoresis.htm%5C%22>http%3A%2F%2Fshiyan.ebioe.com%2FSDS-PAGEelectrophoresis.htm)。

2.匀浆缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)1.0ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。

3.固相载体：PVDF尼龙膜或NC膜（硝酸纤维素薄膜）。

4.转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml (48mmol/L Tris.HCl，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS)。

5.PBS-T(pH7.4)： 0.01mol/L PBS（NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO40.24g）；1g吐温20，加ddH2O至1000ml。

6.膜染色液：考马斯亮蓝 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O 118ml。

7.封闭液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01mol/L PBS中。

8.显色液：化学发光剂（ECL）或DAB 6.0mg，0.01mol/L PBS 10.0ml，硫酸镍胺0.1ml；H2O2 1.0μl。


9.电泳仪，摇床等。

【实验方法与步骤】

基本方法：①将待检测样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离各组分。② 通过印迹技术把分离样品原位、定量转移到NC膜上。③ 用特异抗体与NC膜上的靶抗原反应，结合上的抗体（一抗）再与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白（二抗）进行反应（此步骤类似间接ELISA 法测抗原的反应）。④最后通过酶与底物作用，产生发光或显色反应来检测靶抗原。实际操作时，常把印迹后的NC膜分成两部分，一部分如上所述做免疫检测，另一部分直接进行蛋白质染色，以便对转移情况做直接观察和判断待测抗原所处位置，并推算其分子量。具体操作步骤如下：
1． 蛋白质样品的制备与SDS-PAGE分离

（１）蛋白质样品获得　①细菌诱导表达后，样品一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解；②哺乳动物组织通常可机械分散（机械或超声波室温匀浆0.5～1min）并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液，然后4℃，13 000g离心15min，取上清液作为样品；③组织培养的单层细胞可用匀浆缓冲液裂解，也可直接在SDS凝胶加样缓冲液中裂解；制备好的样品用做SDS- PAGE分析。

（２）电泳　按常规方法进行SDS-PAGE（(见第二十五章 第一节)。

2． 蛋白质从凝胶转移到NC膜上（半干式转移）

（１）平衡凝胶：用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

（２）膜处理: 将滤纸和NC膜，一同在转膜缓冲液中浸泡10min。

（３）转膜：①转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层厚滤纸、PVDF尼龙膜、凝胶、3层厚滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF尼龙膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。②用支架夹紧上述各层，置电转移槽中，NC膜一侧靠正极，凝胶一侧靠负极。接通电源，40V、约1.5A转移1.5～6h。转移时间长短依靶蛋白分子量大小来调节。③转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。④将有蛋白Marker的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。