维生素B2（核黄素）的荧光测定法

维生素B2（核黄素）在440~500nm波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与维生素B2的浓度成正比。利用硅镁吸附剂对维生素B2的吸附作用去除样品中的干扰荧光测定的杂质，然后洗脱维生素B2, 测定其荧光强度。试液再加入连二亚硫酸钠（Na2S2O4），将维生素B2还原为无荧光的物质，再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中维生素B2所产生的荧光强度。

试剂和器材

一、试剂

0.1 mol/L盐酸; 1 mol/L氢氧化钠; 0.1 mol/L氢氧化钠; 20%(w/v)连二亚硫酸钠溶液; 洗脱液：丙酮+冰醋酸+水（5+2+9）; 0.04%溴甲酚绿指示剂; 3%（v/v）高锰酸钾溶液; 3%(v/v)过氧化氢溶液；2.5mol/L无水乙酸钠溶液；硅镁吸附剂：60~100目，sigma 公司产品。

10%木瓜蛋白酶：用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制。

10%淀粉酶：用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制。

维生素B2标准液的配制：

A) 维生素B2标准储备液（25μg/mL）：将标准品维生素B2粉状结晶置于真空干燥器中。经过24小时后，准确称取50mg，置于2L容量瓶中，加入 2.4mL冰乙酸和1.5mL水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷却至室温，稀释至2L，移至棕色瓶中，加少许甲苯复盖于溶液表面，于冰箱中保存。

B) 维生素B2标准使用液：吸取2.00mL维生素B2标准储备液，置于50ml棕色容量瓶中，用水稀释至刻度。避光，贮于4℃冰箱，可保存一周。此溶液每毫升相当于1.00μg维生素B2。

二、材料

新鲜猪肝或干黄豆。

三、器材

试管1.5×20cm（×4）; 移液管10mL（×1）, 1 mL（×2）；容量瓶100mL（×1），10mL（×1）；高压消毒锅，电热恒温培养箱，维生素B2吸附，荧光分光光度计。

操作方法

一、样品提取

1．水解：称取2~10g样品（约含10~200μg 维生素B2）于100ml三角瓶中，加50mL 0.1mol/L盐酸，搅拌直到颗粒物分散均匀。用40ml瓷坩埚为盖扣住瓶口，于121℃高压水解样品30min。水解液冷却后，滴加1mol/L氢氧化钠，用0.04%溴甲酚绿作外指示剂调至pH为4.5。

2．酶解：含有淀粉的水解液：加入3ml 10%淀粉酶溶液，于37~40℃保温约16h。含高蛋白的水解液：加3ml10%木瓜蛋白酶溶液，于37~40℃约16h。

3．过滤：上述酶解液定容至100ml，过滤。此提取液在4℃冰箱中可保存一周。
二、氧化去杂质

视样品中维生素B2的含量取一定体积的样品提取液及维生素B2标准使用液（约含1~10μg维生素B2）分别于 20ml的带盖刻度试管中，加水至15ml。各管加0.5ml冰乙酸，混匀。加3%高锰酸钾溶液0.5ml，混匀，放置2min，使氧化去杂质。滴加3% 双氧水溶液数滴，直至高锰酸钾的颜色褪掉。剧烈振摇此管，使多余的氧气逸出。

三、维生素B2的吸附和洗脱

1．维生素B2吸附柱：硅镁吸附剂约1g用湿法装入柱，占柱长1/2~2/3（约5cm）为宜（吸附柱下端用一团脱脂棉垫上），勿使柱内产生气泡，调节流速约为60滴/min。

2．过柱与洗脱：将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后，用约20ml热水洗去样液中的杂质。然后用 5.00ml洗脱液将样品中维生素B2洗脱并收集于一带盖10ml刻度试管中，再用水洗吸附柱，收集洗出之液体并定容至10ml，混匀后待测荧光。

四、测定

1．于激发光波长440nm，发射光波长525nm测量样品管及标准管的荧光值。

2．待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液（约5~7ml）中加0.1ml20%连二亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20s内测出各管的荧光值，作为各自的空白值。

五、计算

按下式计算样品中维生素B2的含量：

式中： X —样品中含维生素B2的量，mg/100g；

A —样品管荧光值；

B —样品管空白荧光值；

C —标准管荧光值；

D —标准管空白荧光值；

f —稀释倍数；

m —样品的质量，g；

S —标准管中的维生素B2含量，μg；

100/1000 —将样品中维生素B2量由μg/g折算成mg/100g的折算系数。

注意事项

维生素B2极易被光线破坏，实验操作应尽可能避光。