层析技术:生物化学实验常用技术(2)

在分配层析中，大多选用多孔物质作为支持物，利用它对极性溶剂的亲和力，吸附某种极性溶剂作为固定相；用另一种非极性溶剂作为流动相。如果把待分离的混合物样品点在多孔支持物上，在层析过程中，非极性溶剂沿支持物流经样品点时，样品中的各种混合物便会按分配系数大小流动相而向前移动。当遇到前方的固定相时，溶于流动相的物质又将与固定相进行重新分配，一部分转入固定相中。因此，随着流动相的不断向前移动，样品中的物质便在流动相和固定相之间进行连续地、动态地分配。这种情形相当于非极性溶剂从极性溶剂中对物质的连续抽提过程。由于各种物质的分配系数不同，分配系数较大的物质留在固定相中较多，在流动相中较少，层析过程中向前移动较慢；相反，分配系数较小的物质进入流动相中较多而留在固定相中较少，层析过程中向前移动就较快。根据这一原理，样品中的各种物质就能分离开来。分配层析中应用最广泛的多孔支持物是滤纸，称纸上分配层析。其次是硅胶、硅藻土、纤维素粉、微孔聚乙烯粉等。
㈡纸上分配层析
纸上分配层析（纸层析）设备简单、价格低廉，常用于氨基酸、肽类、核苷酸、糖、维生素、有机酸等多种小分子物质的分离、定性和定量。纸层析是以滤纸作为惰性支持物。滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸收22％左右的水，而且其中6％～7％的水是以氢键形式与纤维素的羟基相结合，在一般条件下较难脱去。而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力很小，所以纸层析是以滤纸的结合水为固定相，以有机溶剂为流动相。当流动相沿纸经过样品点时，样品点上的溶质在水和有机溶剂之间不断地进行分配，一部分样品随流动相向前移动，分配，其中的一部分溶质由流动相又进入水相（固定相）。随着流动相的不断流动，各种不同组分按其各自的分配系数，不断地在流动相和固定相之间进行分配，并沿着流动相向前移动，从而使各种物质得到分离和提纯。

离子交换层析

离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是广泛应用于微生物发酵、医药、化工和水质的处理等，分离的对象多为小分子物质。
一、基本原理
离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术。其主要特点是依靠带有相反电荷的颗粒之间具有引力的作用。离子交换层析的固定相是载有大量电荷的离子交换剂；流动相是具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。当混合物溶液中带有与离子交换剂相反电荷的溶质流经离子交换剂时，后者即对不同溶质进行选择性吸附。随后，用带有与溶质相同电荷的洗脱液进行洗脱，被吸附的溶质可被置换而洗脱下来，从而达到分离混合物中各种带电荷溶质的目的。离子交换剂按其所带电荷的性质分为阴离子交换剂和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂本身带有正电荷，可以吸引并结合混合物[的物质；阳离子交换剂本身带有负电荷，可以吸引并结合混合物中带正电荷的物质。
二、离子交换剂的类型
常用的离子交换剂主要有离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖或离子交换琼脂糖凝胶等。
1．离子交换树脂：是由苯乙烯作为单体，苯二乙烯作为关联剂，进行聚合和交联反应生成的具有三维网状结构的高聚物。其上再引入所需要的酸性基团或碱性基团。带酸性基团的属阳离子交换树脂；带碱性基团的属阴离子交换树脂。
2．离子交换纤维素：离子交换纤维素对蛋白质和核酸的纯化极为有用，因为这生物大分子不能渗入到交联的结构中，因此不能在一般的树脂上被分离。而纤维素之所以具有分离、纯化高分子量化合物的能力，是因为它具有松散的亲水性网状结构，有较大的表面积，大分子可以自由通过。因此对生物大分子来说，纤维素的交换能力比离子交换树脂要大，同时纤维素来源于生物材料，洗脱条件温和，回收率高。离子交换纤维素常用的有两种，一种是二乙基氨基纤维素，即DEAE－纤维素，属阴离子交换剂。另一种是羧甲基纤维素，即CM－纤维素，属阳离子交换剂。
3．离子交换葡聚糖或离子交换琼脂糖凝胶：这是将离子交换基团连结于交联葡聚糖或琼脂糖上而制成的各种交换剂。交联葡聚糖和琼脂糖具有三维网状结构，因此这种交换剂既有离子交换作用，又有分子筛作用。

凝胶层析
凝胶层析又称凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析等。它是六十年代发展起来的一种快速简便的分离方法。目前已在生物化学、分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域中得到应用