氨基移换反应的定性鉴定及氨基酸的纸层析

原理
氨基移换酶也称转氨酶。它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮基的α-酮基互换，这种作用称为氨基移换作用。它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上，都起着很重要的作用。转氨酶的种类甚多，任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的最适PH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸-草酸乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT）活力最强。
上述两种酶均广泛存在于生物机体中。在正常人血清中也有少量存在。机体发生肝炎、心肌梗塞等病变时，血清中转氨酶活力常显著增加，在临床上转氨酶活性的测定有重要意义。测定转氨酶活性的方法很多，如分光光度法、纸上层析法及光电比色法等。
本实验利用纸上层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证明组织内氨基移换作用。为了防止丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，可加碘乙酸或溴乙酸以抑制酵解作用或氧化作用。
氨基酸的纸上层析属于分配层析。以滤纸及其结合水作为固定相，把欲分离的混合氨基酸样品加于滤纸上，使流动相（展开剂）经此移动，样品中各组分就在两相溶剂问发生分配现象，在固定相中分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度就慢；在流动相中分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度就快。由于各种氨基酸的分配系数不同，就逐渐集中于滤纸上不同的部位，而彼此分离。层析完毕后，可用茚三酮乙醇液喷洒滤纸，使氨基酸显色形成斑点。组分的比移值（Rf）表示如下：

各种氨基酸都有其特征的Rf值，因此可根据Rf值来鉴定被分离的氨基酸。
操作方法
一、酶液的制备
将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。用表面皿称取1.5克肝脏，放入匀浆器中，再加入 3毫升磷酸缓冲液。研成匀浆后，倒入离心管中，在2500转／分的条件下，离心5分钟，取上清液，即为制备的酶液。
二、体外氨基移换反应
取2支试管，编号。向1号试营中加入15%三氯醋酸溶液10滴和酶液10滴，混匀，静置15分钟，做对照管。向2号试管中加入酶液10滴，然后向1、2号试管各备加入10%谷氨酸溶液10滴、1%丙酮酸溶液10滴、0.1%碳酸氢钾溶液10滴和0.05%碘乙酸溶液5滴，混匀，放入37℃一40℃恒温水浴中保温1.5—2小时。在保温过程中，将试管摇荡几次。保温完毕后取出试管，立即向第2号试管中加入15%三氯醋酸溶液10滴以沉淀蛋白质终止酶反应。将2支试管的内容物分别离心，2500转／分，5分钟。将上清液转移到试管中，用塞塞紧，放置于低温处备用。
二、纸上层析法检查
取4根毛细管，再取10cm×15cm层析滤纸1张。分别将对照上清液（1号管）、样品上清液（2号管），标准谷氨酸溶液和标准丙氨酸溶液点在层析滤纸的基线上。点样时，将毛细管口轻轻触到滤纸上，使每种溶液分别形成直径为2—3毫米的圆斑，两点间隔约1.5cm。为了有足够量样品点在滤纸上，每种溶液应重复点3—4次。待自然风干（或用吹风机吹干），再点下一。点样量应力求均匀相等。
在洁净干燥的小培养皿中，加入约20毫升酚溶剂（展开剂）。将小培养皿放在层析缸底部，加盖密闭，保持10分钟，使缸中展开剂蒸气达到饱和。将滤纸点样端朝下悬挂于层析缸盖中心的挂钩上，放入层析缸，使点样端浸入展开剂中约0.5cm，不要使点样点直接与溶剂接触，加盖密闭，进行层析。待展开剂上升至滤纸上端2cm处时（约需1小时），取出滤纸，用铅笔划上溶剂前沿，室温干燥或吹干。用玻璃喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮无水乙醇溶液，置60℃一80℃烤箱中烘烤5分钟，即出现被染成紫红色的氨基酸斑点。分析比较层析图借，确定各点的氨基酸组成，并解释实验结果。
试剂和器材
一、试剂及材料
（1）实验动物—家兔 （2）1/15M磷酸缓冲液（PH=7.4）
（3）1%谷氨酸溶液（用KOH中和至中性）
（4）1%丙酮酸溶液（用KOH中和至中性）
（5）0.1%碳酸氢钾溶液 （6）0.05%碘乙酸溶液
（7）15%三氯醋酸溶液 （8）标准丙氨酸溶液（0.1%）
(9)标淮谷氨酸溶液(0.1%) (10)0.1%水合茚三酮乙醇溶液
(11)酚试剂:在大烧杯中,加蒸馏水40毫升，再加入新蒸馏的无色的苯酚150克。在水浴中加热搅拌，混合至苯酚完全溶解。将该溶液倒入盛有120毫升蒸馏水的500毫升分液漏斗内，轻轻振荡混合，使其成为乳状液。静止7-10小时，乳状液变成两层透明的溶液，下层为被水饱和的酚溶液（即酚溶液），放出下层，贮存在棕色试剂瓶中备用。
二、器材
（1）层析缸 （2）培养皿
（3）解剖刀、剪及镊子 （4）表面化皿
（5）匀浆器 （6）离心机
（7）毛细管 （8）恒温水浴
（9）吹风机 （10）喷雾器
（11）层析滤纸 （12）针、线