溶菌酶纯度鉴定与分子量测定

一、实验目的和内容

目的：1. 通过本次实验的学习与操作，使学生在实验过程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据；

2. 要求学生掌握电泳原理以及SDS－PAGE垂直板电泳分离蛋白质技术；

3. 熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法，凝胶图谱的绘制与计算；

4. 了解在电泳中分子量标准物的使用。

内容：1．SDS-PAGE电泳的原理：SDS使蛋白质的变性作用，以及此实验中采用的使不连续PAGE胶（分离胶和浓缩胶）的原理；

2．SDS－PAGE电泳进行纯度鉴定的原理：凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关；

3．电泳的操作：制胶、加样、电泳、拨胶、凝胶染色与脱色；

4．蛋白条带的观察以及分子量的估算。

二、实验仪器与试剂

1．实验仪器

　　SDS-PAGE电泳设备，电炉，脱色摇床

易生物仪器库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

2. 实验材料及试剂

实验材料：蛋清（S1）、粗分离样品（S2）、离子交换层析中穿透峰下降段样品（S3）、离子交换层析洗脱峰样品（S4），橡胶手套

实验试剂：2×上样缓冲液、10%SDS、30%丙烯酰胺贮存液、分离胶缓冲液（1.5 mol/LpH8.8 Tris-HCl 缓冲液）、浓缩胶缓冲液（0.5 mol/LpH6.8 Tris-HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵(AP)、TEMED、pH8.3 Tris-Gly电泳缓冲液、1%琼脂糖溶液、染色液、脱色液

三、实验步骤

（一）蛋白样品的处理

取200µL 上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中，加入200µL 的2×上样缓冲液，混匀，轻轻盖上盖子，封口膜封紧瓶口以免加热时迸出，在100℃沸水浴中加热3～5min，取出后10000r/min 离心10min，取上清待用。

（二）SDS-PADE实验步骤（适用于大板，若为天能公司的小板，参考附录中的方法）

1．电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。( 试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。)

2．用电泳缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶，煮沸溶解后冷却至55℃左右，加入制板槽槽内封板。（固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.）

3．按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。（凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。）

4．倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样梳，静置25分钟。（样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。）

5．拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。（要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.）

6．加样5个，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白Marker。其中蛋清（S1）和Marker加样量为2µL，S1、S2、S3、和S4加样量为10µL。为了练习和比较上样量的影响，可以加20µL的S1～S4作为对照（注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。）

7．电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在160V，当进入分离胶后改为240V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。

8．凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液，42℃染色40min左右。（剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。）

9．脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。

10．将凝胶室温保存于10％甘油水溶液中，至凝胶扫描分析。

11．凝胶扫描仪扫描并进行数据分析,求出溶菌酶的相对分子质量。分析各样品中溶菌酶相对含量的变化。

附表1

 

浓缩胶 （10mL）	双蒸水	0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl	胶贮液	10%SDS	TEMED	10%AP
4%	6.1mL	2.5mL	1.3mL	100μL	10μL	100μL

附表2

 

分离胶 （20mL）	双蒸水	1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl	胶贮液	10%SDS	TEMED	10%AP
12%	6.6mL	5mL	8mL	200μL	8μL	200μL

汇总所有实验结果，完成下表：

 

样品	体积 mL	蛋白浓度mg/mL	总蛋白 Mg	活力 u/mL	比活力 u/mg	总活力 U	回收率 %	提纯倍数
S1	V1＝						100	1
S2	V2＝
S4	V4＝

其中：总活力＝比活力×体积

回收率＝回收的样品活力占总活力的百分数

提纯倍数＝提纯的比活力与初始比活力的比值

四、注意事项

1．N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。

2．安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。

3．用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。

4．加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。

五、演示

1．垂直电泳系统的组成及工作原理；

（1）电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽

（2）电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳200～600V，载体两性电解质等电聚焦电泳1000～2000V，固相梯度等电聚焦3000～8000V

（3）外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却；

（4）灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子；

（5）其他：可以选配电泳转移装置、电泳洗脱仪、凝胶扫描和摄录装置等。

2．制分离胶与浓缩胶