溶菌酶分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定-3

同时，为了监测分离纯化的效果，我们必须对相应的结果进行检测。对于酶而言，主要通过其催化特异的反应进行监测。溶菌酶对革兰氏阳性菌的细胞壁有明显的破坏作用，可利用这一特性进行溶菌酶活性的监测，以便我们区分在纯化过程中，含有溶菌酶的组分。

类似的采用 DEAE- 纤维素对抗体进行精制，特别是经过初步纯化后的 Ig 的纯化，效果尤为显著。 IgG 的等电点为 pI 8.0 ， IgM ， IgA 的等电点为 pI 7.0 ， 7.4 ，在 pH 8.0 时 IgG 带正电荷，不能被 DEAE-纤维素吸附而被洗脱下来，被 DEAE- 纤维素吸附的其它球蛋白，可用逐渐增加洗脱液中 PO4 3- 浓度的方法将其逐一洗脱，或降低 pH 使之洗脱出来。

目前常用的离子交换纤维素列于下表：

 

DEAE－ 纤维素	形状	长度 （微米）	交换当量 （mg当量/g）	蛋白吸附容量 （毫克/克）		床体积（毫升/克）
				胰岛素（pH8.5）	牛血清清蛋白（pH8.5）	pH6.0	pH7.5
DE-22 DE-23 DE-32 DE-52 CM－纤维素 CM-22 CM-23 CM-32 CM-52	改良纤维性 * 同上（除细粒） 微粒性（干粉） 同上（溶胀） 改良纤维性 改良纤维性（除细粒） 微粒性（干粉） 微粒性（溶胀）	12~400 18~400 24~63 24~63 12~400 18~400 24~63 24~63	1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 0.6±0.06 0.6±0.06 1.0±0.1 1.0±0.1	750 750 850 850 溶菌酶 (pH5.0) 600 600 1,260 1,260	450 450 660 660 7S－γ球蛋白（pH5.0） 150 150 400 400	7.7 8.3 6.0 6.0 pH5.0 7.7 9.1 6.8 6.8	7.7 9.1 6.3 6.3 pH7.5 7.7 9.1 6.7 6.

（二）离子交换层析

蛋白质进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱下来。余下的蛋白质均结合在树脂上，利用其蛋白质表面电荷性质的不同，与树脂的亲和力也各不相同，利用不同强度的离子溶液，将其分别洗脱下来达到分离、纯化蛋白质的目的。

以下对操作过程的要点进行说明。

1. 离子交换剂预处理和装柱

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带 H + 或 OH - 的交换剂型。阴离子交换剂常用 “碱 -酸-碱” 处理，使最终转为-OH -型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用 “酸- 碱-酸” 处理，使最终转为-H -型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的 pH 和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。

2. 加样与洗脱

加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的 pH 和离子强度，所选定的 pH 值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的 1％－5%。加样蛋白浓度低于20 mg/mL，上样体积小于柱体积的1/3 。

洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的 pH 或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变 pH 与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变 pH 或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同 pH 与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱 pH 与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱：两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定 pH 的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同 pH 的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中某一时间的盐浓度可用下式进行计算： C ＝ C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1 式中 A 1、A 2分别代表两容器的截面积： C1、C2分别表示容器中溶液的浓度； V 为流出体积对总体积之比。当 A 1 ＝A 2 时为线性梯度，当A 1＞A 2时为凹形梯度， A1＞A2 时为凸形梯度。 进行离子交换层析的最佳洗脱 溶液 pH 值一般与预分离蛋白质的等电点相差一个单位。这使蛋白质的净电荷量能保证将其结合在离子交换树脂上，又不需在洗脱时采用高强度的离子浓度或 pH 值相差悬殊的苛刻的洗脱条件。

洗脱时应满足以下要求： ① 洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致太拥挤。 ② 梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。 ③ 梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。 ④ 流速： 1 mL/cm 2 · min ，过快会吸附不完全，分离不清，洗脱峰平坦。

3. 洗脱馏份的分析

按一定体积（ 5-10 mL/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。

4. 离子交换剂的再生与保存

离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用 2 mol/L NaCl 淋洗柱，若有强吸附物则可用 0.1 mol/L NaOH 洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为： 0.5 mol/L NaOH- 水 - 乙醇 - 水 -20 % NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用 0.002 % 氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（ 0.005％）。有些产品建议用 0.02％叠氮钠。

离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。

填料相关资料，还可以参考GE Pharmacia公司网站，或者Biorad公司网站。