层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识-2

当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。

当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为:

A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A

A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A

（二）部分收集器的操作方法：

1.将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和“停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或“慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开"慢"和“定”，再按一下"停"设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒”键。

2.定位，将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。

七、背景资料

凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后从柱中流出。

凝胶层析常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子, 也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的分子质量等方面。以下对凝胶层析的使用进行具体介绍。
图1 凝胶层析的原理
（一） 层析柱
层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用 20 -30cm 长的层析柱，分级分离时，一般需要 100cm 左右长的层析柱，其直径在 1 -5cm 范围内，小于 1cm 产生管壁效应，大于 5cm 则稀释现象严重。由于层析柱的直径大小不影响分离度，所以样品量大时可用大直径的层析柱 (一般制备用凝胶柱，直径大于 2cm , 但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上 ) 。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过 1m。 ⑴ 分组分离时用短柱，一般凝胶柱长 20－30cm ，柱高与直径的比较 5:1─10:1 ，样品溶液体积应小于 凝胶床体积为的 20% 。 ⑵ 分级分离时柱高与直径之线为 20:1─100:1 （层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的 1/1000 ），样品溶液体积 应小于 凝胶床体积为的 5 % 。 ⑶ 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。适用的凝胶为 SephadexG-10 、 15 、 25 或 Bio-Gel-p-2 、 4 、 6 。柱长与直径之比为 5-15 ，样品体积可达柱床体积的 20 — 25 % ，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
（二）凝胶的类型
常用凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。具体的种类型号及性能列表如下：

种类及主要用途	化学组成	部分 型号	颗粒大小 （/目数）	分离性能（Da）	溶胀时间/h
					20-25℃	90-100℃
葡聚糖凝胶（Sephadex G-）	由葡聚糖和甘油基通过醚桥交联而成	G-10	100-200	＜700	3	1
		G-15	120-200	＜1500	3	1
		G-25	50-400	100-5,000	3	1
		G-50	50-400	500-30,000	3	1
		G-75	120-400	1,000-8,000	24	3
		G-100	120-400	1,000-15,000	72	3
		G-150	120-400	1,000-30000	72	5
		G-200	120-400	1,000-60,000	72	5
聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel p-­）	由丙烯酰胺和双丙烯酰胺共聚而成	P-2	50-400	200-1,800	4	2
		P-4	50-400	800-4,000	4	2
		P-6	50-400	1,000-6,000	4	2
		P-10	50-400	1,500-20,000	4	2
		P-30	50-200	2,500-40,000	12	3
		P-60	50-200	3,000-60,000	12	3
		P-100	50-200	5,000-100,000	24	5
		P-150	50-200	15,000-150,000	24	5
		P-200	50-200	50,000-20,000	48	5
		P-300	50-200	60,000-400,000	48	5
琼脂糖凝胶（Sepharose gio-gel ）	由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接而成，为中性琼脂糖	A 0.5m	50-400	＜10,000-500,000
		A 1.5m	50-400	＜10,000-1,500,000
		A 5m	50-400	10,000-5,000,000
		A 15m	50-400	10,000-15,000,000
		A 50m	50-400	100,000-50,000,000
		A 150m	50-200	1,000,000-150,000,000

（三）凝胶的选择

根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的 2 倍，例如 Sephadex G-200 的吸水量为 20 ， 1 克 Sephadex G─200 吸水后形成的凝胶体积约 40mL 。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用 100-200 号筛目的的 Sephadex G-200 效果好； 脱盐用 Sephadex G-25 、 G-50 ，用粗粒，短柱，流速快。

（四）凝胶的制备

商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在 1-2 小时内即可完成。特别是在使用软胶时， 自然膨胀需 24 小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。

（五）样品溶液的处理

样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过 Sephadex G-15 短柱除去。样品的粘度不能太大，否则影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。

（六）防止微生物的污染

交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：

（1）叠氨钠（ NaN3） 在凝胶层析中只要用 0.02 ％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在 20 ℃ 时约为 40 %。它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性，但可干扰荧光标记蛋白质。

（2）可乐酮 [Cl 3C-C(OH)(CH3)2 ] 在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02 % 。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于 60℃ 时易引起分解而失效。

（3）乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为 0.05-0. 01 %。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。

（4）苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为 0.001%-0.01 %。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。

除了直接加入抑菌剂，在位消毒 （Sanitization-in-place, SIP）和在位清（Cleaning-in-place，CIP）对层析介质和仪器的保养十分重要。SIP的目的是将微生物感染减到最低，绝大多数的微生物可用0.5-1M NaOH以该凝胶的建议流速洗约0.5-1小时消除。CIP的目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。凝胶在使用十次以后，最少做一次CIP。事实上，做CIP 时，往往已经包含了SIP，不必再重复。新一代Bioprocess凝胶由于拥有很高的化学稳定性，大都可用至1-2M NaOH在位清洗。BioProcess离子交换、疏水层析介质以40cm/h, 用0.5-2M NaOH相反方向洗四个体积，再以最少3cv平衡缓冲液再生。凝胶过滤介质CIP 的方法相同。但流速需减至20cm/h，接触至少一至二小时。SOURCE介质用二至五个柱体积1M NaCl、1M NaOH、1M HCl、1M NaCl 的顺序以180cm/h 洗柱。每个溶液间需用二个柱体积蒸馏水过柱。去除脂类及疏水性强的蛋白, 使用递增式梯度以4~10cv 70%乙醇或30%异丙醇洗柱，再用最少3cv蒸馏水加以过柱。或用2cv 0.5% 非离子性去污剂 [溶在1M乙酸中] 洗柱，再用五个柱体积70% 乙醇过过柱，最后用3～4cv蒸馏水加以清洗。

（六）凝胶回收

如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用 70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达 90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。

参考文献

[1] 王璞，林红,朱滨.凝胶过滤层析实验中Sephadex的溶胀与回收保存.实验技术与管理,2006,23 (2):24-25.