盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白

原理

盘状聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量的交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。

改变单体的浓度或单体与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，将次凝胶灌装于直立的玻璃管中，再加样品，进行电泳分离，称为盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳。一般常采用7.5%的盘状聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，2.4%的分离核酸。

盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳又常分为两大类，第一类是连续的凝胶电泳，第二类是不连续的凝胶电泳

不连续的凝胶电泳亦可称为盘状电泳。在这种电泳过程中，除去一般的电荷效应外，还有两种物理效应：

（1）凝胶对样品分子的筛选效应：颗粒小，形状为圆球形的样品分子，移动较快；颗粒大形状不规则的样品分子，通过凝胶孔洞时受到的阻力较大，移动较慢。

（2）不连续系统对样品的浓缩效应：高度的浓缩效应，大大提高电泳分离的分辨率，特别适用于稀浓度的样品的分离。

 

关于不连续系统的浓缩效应，可由两方面进行分析（以碱性pH缓冲液体系为例）

第一，两层凝胶孔径不同。

第二，缓冲液与凝胶的离子成分和pH不同。

本实验采用不连续系统，碱性缓冲体系，分离血清蛋白质。由于具有电荷效应、分子筛效应、浓缩效应，所以分离效果好，分辨率高。实验中聚合凝胶时表面覆盖一层水，是为了防止空气中的氧气进入混合液，使聚合作用受抑制，并保证胶面的平整。

步 骤

1 分离胶的制备：TEMED（pH8.9）2mL；分离胶原液 4mL； A.P（0.14%） 10mL（加样顺序不可颠倒）。

2 浓缩胶的制备：TEMED（pH6.7） 1mL；浓缩胶原液 2mL；核黄素（0.1mg／ml），1ml。

3 上槽（略）

4 加样：BSA、胃蛋白酶各10-20μL，混合样品30-40μL，猪血清5-10μL，加1/2体积的蔗糖。

5电泳：2mA/管，10-20分钟后，于3mA/管电泳至溴酚蓝指示剂离胶下端0.5cm时，停止电泳。

6剥胶，染色。

7脱色

8绘图，计算Rf值。