凝胶层析法(gel chromatography)脱盐和分离蛋白质-2

葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G–10至G–200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/2干胶。市售有G–10、G–5、G–50、G–75、 G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。
葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说Sephadex G–l0～15通常用于分离肽及“脱盐”。 Sephadex G–75～200用以分离各类蛋白质。
凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性，不与被分离物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐缓冲液作洗脱液。
2．操作
（1）凝胶溶胀（水化） 商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒。使用前必须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶胀。
凝胶溶胀有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀；另一种 是置于沸水浴中溶胀。各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见下表：

必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀。两种方法中，沸水浴溶胀不但节省时间，还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼中气体。
凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。
一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在5ml量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积。然后在层析柱中加水到所需柱床高度，将水倒出，量取柱床体积。根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积，即可推算出干胶的需要量。

（2）装柱 将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。层析柱有玻璃和透明塑料的两种。柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结玻璃砂板或尼龙布，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。如果没有市售的层析柱，可以选用粗细均匀，长短合适的玻璃管，在两端塞上合适的胶塞，胶塞中插人细玻璃管，在一端放一层尼龙布为出口，即可作为层析柱使用。层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层析时间长，样品易稀释造成扩散，反而影响分离效果。柱的内径不宜较细，直径1cm以下的柱易发生“管壁效应”，即柱中部分的物质组分移动较快，管壁周围的则移动较慢，造成分离混乱。当然柱的内径也不宜过粗。
凝胶层析中，在把小分子物质（mw<1 500），如无机或其他物质与大分子物质 （mw<20 000）分离时，层析柱的体积一般约为样品的4–10倍，高度与直径的比例为5：1至15：1之间。这类柱也称为“脱盐” 柱，常用网孔很小的凝胶如G–25。用以将生物大分子物质彼此分开的分级层析柱，体积应为样品体积的25～100倍。柱长度与直径的比例为 20：1～100：1。
装柱的操作过程如下：将层析柱垂直固定在支架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面上的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶柱高度时，立即关闭下口，待凝胶自然沉降形成凝胶柱床。凝胶柱床一般应离柱顶3~5cm，并覆盖一层溶液。