下游纯化工艺简介-2

（2）样品预处理
a、去除样品中颗粒物（0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟）
b、去除样品中脂类（10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提）
c、去除样品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀）
d、抑制样品中蛋白水解酶（加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白）

表 2 样品中有害杂质及去除办法

 

杂质	害处	预防措施
颗粒物	堵塞柱子	增大反压力 0.45-0.22微米膜过滤；10000 g 离心10-15分钟；细胞匀浆，4000-5000 g离心30分钟。
脂类	封闭介质配基、导致沉淀、导致非特异吸附	10000 g离心10-15分钟；若目标分子稳定，用有机溶剂抽提
核酸	高粘度、封闭介质结合位点	加入 核酸酶消化，或使核酸沉淀
蛋白酶	降解目的蛋白 加入蛋白酶抑制剂	用亲和色谱除去蛋白酶；快速进行第一步分离；低温下进行分离；在蛋白酶缺陷的宿主中表达重组蛋白

 

由于不同的色谱方法的原理不同，其对样品的要求也不相同，所以必须在进行色谱之前，根据特定色谱方法的要求对样品进行进一步的处理。如下表所示：

表3 不同色谱方法对于样品的要求

 

样品参数	离子交换色谱	疏水作用色谱	凝胶过滤色谱
样品体积	无限制	无限制	一般柱体积的1-5%
样品量	最大理论载量的10-20%	最大理论载量的10-20%	仅受到样品粘度限制
样品粘度	约<50mg/ml	约<50mg/ml	约<50-100mg/ml
pH值／盐浓度	同平衡缓冲液（低盐）	同平衡缓冲液（高盐）	仅受介质与样品稳定性限制
有机溶剂	为减少非特异吸附,可加入有机溶剂(<30%)	分离后，可用有机溶剂进行清洗	仅受介质与样品稳定性限制

 

（3）样品的保存条件： 短期储存（小于24小时）
a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀
b、在密闭容器中冰箱冷藏
较长期储存（数天）
a、b、同上
c、加入适当的抑菌剂
长期储存
a、同上
b、冰冻或者最好冻干（真空冷冻干燥）保存。
3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立
a、目的蛋白含量测定
酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。
b、总蛋白含量测定
紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法（考马斯亮兰G-250）等。
c、样品复杂度检测
HPLC（离子交换、凝胶过滤、反相）、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳（CE）。