下游纯化工艺简介-1

Downstream（下游）与上游相对的概念，一般而言，上游指基因克隆、细胞培养等目的产物表达工序，下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。美、日、欧等发达国家生物技术产品工业化的实践证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。
一、纯化工艺常用衔接技术：
1、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(<-20℃)中可以长期保存。
2、等电点沉淀。根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。
3、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的乙醇分级沉淀。
4、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进行透析，可以起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。
5、超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量(MWcutoff)的超滤膜进行超滤。
6、真空冷冻干燥。利用在低温和高真空条件下，冰不经融化为液态水而直接升华为水蒸气的原理。可以很好地浓缩样品和保存蛋白质、多肽的生物活性。
7、变性沉淀。根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较高的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。例如胸腺肽制备中使用的热变性(~80℃)去除杂蛋白。如果目的蛋白、多肽本身热稳定性、酸碱稳定性不高则不宜采用。
8、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术，常采用高速冷冻离心机进行。
9、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，Sephadex G25、G50常用于蛋白质脱盐。
10、过滤
澄清过滤、除菌过滤（0.22微米膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）
二、蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介
chromatography，色谱，层析
表1 常用的液相色谱纯化方法及其原理

方法	分离原理	基于
凝胶过滤（GF）	分子大小/形状	分子形态
离子交换色谱（IEX）	分子所带电荷	Asp、Glu、Lys、Arg、His等带电 氨基酸
疏水作用色谱（HIC）	表面疏水性	Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、Pro、Met、Val、Ala等疏水性 氨基酸
金属螯合色谱（IMAC）	分子与金属形成配位键	His、Trp、Cys
亲和色谱	特异生物识别作用	抗原 -抗体，酶-底物，酶-抑制剂等
共价结合色谱	共价结合	巯基（Cys）

1、纯化的一般目标和方法

首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤（例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等）成为稳定的可以用于色谱分离的样品。

然后进行捕获色谱（capture chromatography），主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质，此步最关心的是流速和载量，常采用高载量、快流速凝胶。

经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱（intermediate chromatography），目的是去除较难去除的杂质，此步最关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗粒凝胶。

最后为了得到符合要求的最终产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断，进行精制色谱（polishing chromatography），常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。

2、纯化前的准备工作

（1）样品稳定性试验

a、测定样品在pH 2-9的稳定性；

b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性；

c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；

d、测定样品在4-40℃的稳定性；

e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。