蛋白质标准曲线的制作（马斯亮蓝法）

一、实验目的和内容
目的: 学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法
内容：制作测定蛋白质浓度的标准曲线。
制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G－250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm吸光度可测定蛋白质的含量。另外，反应体系中呈现的颜色变化主要是G-250分子间疏水相互作用形成的聚集体聚集程度不同引起的。单体形式表现为蓝色，单体和聚集体共存时表现为绿色，全为聚集体形式呈现为棕红色。影响因素主要为溶液体系中磷酸、乙醇、NaCl的含量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/mL时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
二、实验仪器和试剂
（一）试剂
1. 考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G－250 100mg溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

2. 标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白(BSA)，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。
（二）器材
721型分光光度计、移液管（10mL）、移液枪、试管及试管架

 

试管编号	0	1	2	3	4	5
1mg/mL标准蛋白（mL）	0	20	40	60	80	100
0.15mol/L NaCl （mL）	1	0.98	0.96	0.94	0.92	0.9
考马斯亮蓝试剂 （mL）	5	5	5	5	5	5
充分摇匀，20min内以0号管为空白对照,在595nm测定
A595nm	－

 

 

三、实验步骤

以A_595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为20µg、40 µg、60 µg、80 µg、100 µg），在坐标轴上绘制标准曲线。

1. 利用标准曲线查出回归方程。

2. 用Excel作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X。相关系数一般大于0.9。

3. 未知样品蛋白质浓度的测定：

测定方法同上，取合适体积的未知样品，使其测定值在标准曲线的直线范围内（0～100µg，最好在40～80µg），根据所测定的A_595nm，利用标准曲线或回归方程求出相当于标准蛋白质的量（µg），从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。

一般被测样品的A_595nm值在0.1—0.5之间，所以上述样品如果A_595nm值太大，可以减少取样量，如果仍然很大，可以定量稀释后再进行测定。

四、注意事项：
（一）蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内基本稳定。如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
（二）测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
1．Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
2．有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。
3．测定时仅使用一套比色杯（2个），并从低浓度到高浓度依次测定。中间不要用蒸馏水润洗比色杯，仅用待测液润洗2～3次即可。
另外，还要注意，玻璃