蛋白质的定量测定实验（Lowry法、考马氏亮蓝G－250染色法、紫外

2、血清蛋白质测定
稀释血清（或其它蛋白样品溶液），准确吸取0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。再取三只试管，分别标以1、2、3号，按下表操作。混匀后室温放置15分钟，在595nm波长比色，计算蛋白质浓度。

 

 

试剂(毫升)	1(空白管)	2(标准管)	3(样品管)
蒸　馏　水	0.1	—	—
蛋白质标准	—	0.1	—
稀释血清	—	—	0.1
染　色　液	3	3	3

 

【计 算】
每100毫升血清中蛋白质的含量（g％）＝

【试 剂】
1、考马氏亮蓝G－250染色液：
称取100mg考马氏亮蓝G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100 毫升85％的磷酸，加入稀释到1升。
2、蛋白标准（0.1mg/ml）
准确称取10mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装，－20℃冰箱保存。

【注意事项】
1、常用试剂的干扰：有些常用试剂在测定中会受到不同程度的干扰。Tris、巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及少量去垢剂有较少影响，而1％SDS、1％ TritonX-100及1％Hemosol的干扰严重。
2、显色结果受时间与温度影响较大，须注意保证样品与标准的测定控制在同一条件下进行。
3、考马氏亮蓝G－250染色能力很强，特别要注意比色杯的清洗。颜色的吸附对本次测定影响很大。可将测量杯在0.1mol/L HCl中浸泡数小时，再冲洗干净即可。

三、紫外分光光度法
紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是将蛋白质溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法，不需要任何试剂，操作很简便，而且样品可以回收。
【原 理】
蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的，所以光密度受这两种氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。
【操 作】
将待测蛋白质溶液适当稀释K倍，在紫外分光度计中分别测定样品在10mm光径石英比色皿中，分别在280nm及260nm两种波长下的吸光度值A280和A260

【计 算】
1、当蛋白样品的吸光收比值A280／A260约为1.8，可用下面的公试进行计算：
蛋白质浓度（mg/ml）＝（1.45A₂₈₀ －0.74A₂₆₀）×K
2、也可以先计算出A280／A260的比值后从下表中查出校正因子 “F”值，由下面的经验公式计算出溶液的蛋白质浓度。同时从表中还可以查出样品中混杂的核酸的百分含量：
蛋白质浓度（mg/ml）＝F×A280 ×K

 

 

A280/A260	核酸(%)	F	A280/A260	核酸(%)	F
1.75	0.00	1.116	0.846	5.50	0.656
1.63	0.25	1.081	0.822	6.00	0.632
1.52	0.50	1.054	0.804	6.50	0.607
1.40	0.75	1.023	0.784	7.00	0.585
1.36	1.00	0.994	0.767	7.50	0.565
1.30	1.25	0.975	0.753	8.00	0.545
1.25	1.50	0.944	0.730	9.00	0.508
1.16	2.00	0.899	0.705	10.00	0.478
1.09	2.50	0.852	0.671	12.00	0.422
1.03	3.00	0.814	0.644	14.00	0.377
0.979	3.50	0.776	0.615	17.00	0.322
0.939	4.00	0.743	0.595	20.00	0.278
0.874	5.00	0.682

 

 

注：一般纯净蛋白质的光吸收比值A280/A260约为1.8，而核酸A280/A260的比值约为0.5。
【方法评价】
操作简便、样品溶液可回收，同时可估计核酸含量。但核酸含量小于20％或溶液混浊、则测定结果误差较大。在使用上表和公式计算时也应注意各种蛋白质和各种核酸在 280nm及260nm处的光吸收值也不尽相同，故计算结果有一定误差。
四、双缩脲法
【原 理】
利用半饱和硫酸铵或27.8％硫酸钠——亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来，而此时血清白蛋白仍处于溶解状态，因此可把两者分开，这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的方法称为盐方法。盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学，而且还广泛地用于生物化学研究工作中，如一些特殊蛋白质—酶、蛋白激素等的分离和纯化。
蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可于蛋白质的定量测定。
但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物
以及分子内有—CH2—NH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。本实验用27.8％硫酸钠—亚硫酸钠溶液稀释血清，取出一部分用双缩脲反应测定蛋白质的含量，剩余部分则用滤纸过滤，使析出的球蛋白与白蛋白分离，取出滤液用同一反应测定白蛋白的含量。总蛋白与白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白与球蛋白之比即所谓的白／球比值。
【操 作】
1、取中试管4支，分别标以“1”、“2”、“3”、“4”，吸取27.8％硫酸钠—亚硫酸钠1ml，置“1”管中备用。
2、吸取血清0.2ml于另一试管中，加27.8％硫酸钠一亚硫酸钠4.8ml，用拇指压住管口倒转混合5～6次，放置约15秒，用1ml刻度管吸取1ml置于管 “4”中（总蛋白测定管）。
3、将剩余的血清混悬液（如滤液不清，可重复过滤，直至澄清为止），用另一支1ml刻度吸管取此液1ml，置于管 “3”（白蛋白测定管）。
4、另用一支1ml刻度吸管吸取标准血清1ml，置管“2”中（标准管）。
5、于上述4支试管中分别加入双缩脲试剂4ml，混匀。
6、在室温下放置10分钟后，以管“1”（空白管）调零，在540nm的波长下进行比色，分别记录“2”、“3”、“4”管的光密读数
【计 算】

血清球蛋白含量（克／100ml）＝总蛋白含量—白蛋白含量
白：球比值＝白蛋白含量／球蛋白含量。
【临床意义】
正常人每100ml血清中含蛋白质6～8克，平均7克左右，白／球比为1.5～2.5:1。长期营养不良，肝脏疾病，慢性肾炎时，总蛋白含量降低；大量失水（如呕吐、腹泻）时则升高。肝脏疾病、慢性肾炎以及慢性传染病有大量抗体生成时，白／球比值变小，甚至倒置。
【试剂与器材】
（一）器材
1、中试管 6支。
2、刻度吸管：0.2ml、5ml、10ml、1ml。
3、玻璃漏斗。
4、快速滤纸。
5、分光光度计。
（二）试剂
1、27.8％硫酸钠—亚硫酸钠溶液：取浓硫酸2ml加到900ml蒸馏水中，将此含酸蒸馏水加于盛有无水硫酸钠208克及无水亚硫酸钠 70克，的烧杯中，边加边搅拌，待液解后全部移至1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。取此溶液1ml，加蒸馏水24ml，检查其pH，应为7或略高于 7，本试剂应贮于25℃温箱中。
2、双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.5克及石酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）6克，分别用适量蒸馏水溶解，混合后加入10％NaOH溶液300ml，最后加蒸馏水至1000ml。
3、标准血清：取经凯氏定氮标定后的血清用15％的 NaCl溶液稀释25倍，贮于冰箱中备用。
【注意事项】
（一）硫酸钠的溶解度与温度有关，温度低于30℃易结晶析出，故室温较低时应在37℃水浴或恒温箱进行保温。
（二）血清样品必须新鲜，如有细菌污染或溶血，则不能得到正确的结果。
（三）含脂类较多的血清，可用乙醚3ml抽提一次后再进行测定。