蛋白质的定量测定实验（Lowry法、考马氏亮蓝G－250染色法、紫外

蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：
物理性质：紫外分光光度法
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体金法
染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法
其他性质：荧光法
蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。

常用的测定蛋白质含量方法的比较

方 法	测定范围 （μg/ml）	不同种类 蛋白的差异	最大吸收 波长(nm)	特 点
凯氏定氮法		小		标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定
紫外分光光度法	100—1000	大	280 205	灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响
双缩脲法	1000—10000	小	540	重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大
Folin-酚试剂法	20—500	大	750	灵敏，费时较长，干扰物质多
考马氏亮蓝G-250	50—500	大	595	灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移
BCA	50—500	大	562	灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长

由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。

一、 Folin－酚试剂法（又名Lowry）法
目前实验室较多用用Folin-酚法测定蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。
【原 理】
蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。
【操 作】
1、标准曲线的制备：
按下表操作，在 试管中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml蛋白标准溶液，用生理盐水补足到 1ml。加入5ml的碱性酮试剂，混匀后室温放置20分钟后，再加入0.5ml酚试剂混匀。

编 号	1	2	3	4	5	6
蛋白标准（ml）	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
0.9% NaCl（ml）	1.0	0.8	0.6	0.4	0.2	0
碱性酮试剂（ml）	5	5	5	5	5	5
混匀后室温(25℃)放置20分钟
酚试剂（ml）	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5

30分钟后，以第1管为空白，在650nm波长比色，读出吸光度，以各客的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。

2、血清蛋白质测定。
稀释血清（或其它蛋白样品浓度）：准确吸取0.1ml血清，置于50ml容量瓶中，用生理盐水释释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。再取三只试管，分别标以1、2、3号，按下表操作：

 

 

编 号	测定管	标准管	空白管
稀释标本(ml)	0.2	—	—
稀释标准液(ml)	—	0.2	—
0.9%NaCl(ml)	—	—	0.2
碱性酮液(ml)	1.0	1.0	1.0
混匀后于室温放置20分钟
酚试剂(ml)	0.1	0.1	0.1

 

 

混匀各管，30分钟后，在波长650nm比色，读取吸光度。
【计 算】
1、以测定管读数查找标准曲线求得血清蛋白含量。
2、无标准曲线时，可以与测定管同样操作的标准管按下式计算蛋白含量：
血清蛋白含量（g%）＝

【试剂配制】
1、碱性酮溶液：
甲液：Na₂CO₃2g溶于0.1mol/L NaOH 100ml溶液中。
乙液：CuSO₄•5H₂O 0.5克溶于1％酒石酸钾100ml中。
取甲液50ml，乙液1ml混合。此液只能临用前配制。
2、酚试剂：

取Na2WO4•2H2O 100g和Na2MoO3•2H2O 25g，溶于蒸馏水700ml中，再加85％H3PO4，50ml和HCl（浓）100ml，将上物混合后，置1500ml园底烧瓶中温和地回流10小时再加硫酸锂（Ll2SO2•H2O）150g，水50ml及溴水数滴，继续沸腾15分钟以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml，然后过滤，溶液应呈黄色（如带绿色者不能用），置于棕色瓶中保存。使用标准NaOH滴定，以酚酞为指示液，而后稀释约一倍，使最后浓度为lN。
3、蛋白标准液（0.1mg/ml）
准确称取10mg牛血清蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度。溶后分装，放于－20℃冰箱保存。
【注意事项】
1、Tris缓冲液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚类、柠檬酸以及高浓度的尿素、胍、硫酸钠、三氯乙酸、乙醇、丙酮……等均会干扰Folin-酚反应。
2、当酚试剂加入后，应迅速摇匀（加—管摇一管）以免出现浑浊。
3、由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光红外光区呈现较宽吸收峰区。不同实验室选用不同波长，有选用500或 540nm，有选用640nm，700或750nm。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收，本实验选用波长650nm。

二、考马氏亮蓝G－250染色法
此方法是1976年Bradform建立。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。
【原 理】
考马氏亮蓝G－250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与 595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。
【操作步骤】1、标准曲线的制备：
按下表操作，在试管中分别加入0、20、40、80、100微克蛋白标准溶液，用水补足到100微升，加入3ml的染色液，混匀后室温放置15分钟。

 

 

编　　　号	1	2	3	4	5	6
蛋白标准(ml)	0	0.02	0.04	0.06	0.08	0.10
蒸馏水(ml)	0.10	0.08	0.06	0.04	0.02	0
染色液(ml)	3	3	3	3	3	3

 

 

在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。