核酸凝胶电泳-1

核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯下确定DNA在凝胶中的位置。
一、影响核酸电泳的因素
1、核酸的性质
核酸的电荷量，分子大小，分子的空间构象等决定了不同的核酸分子具有不同的迁移率。对于线状双链DNA分子，在凝胶电泳中，分子量的常用对数与泳动率成反比关系，一般双链DNA基本上不存在影响迁移率的复杂构象，但分子的空间构象也影响泳动速率，如分子量相同的质粒DNA 迁移速率则是：闭环型>线性>单链开环型。
对于单链RNA或DNA，其在凝胶电泳中的迁移率受碱基组织和序列的影响，同等大小的核酸可能由于空间构象不同而使迁移率不同，故可利用变性凝胶电泳分离纯化单链核酸。
2、凝胶孔径的大小：
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段，琼脂糖凝胶的孔径大，分辨率低，但分离范围广，约100bp~50kb的DNA；PAG的孔径小，分离小片段（5~500bp）DNA效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。凝胶孔径的大小是影响核酸在凝胶电泳中迁移率的最基本因素 它决定了能被分离的片段的大小。下表列出不同凝胶浓度与其分离DNA分子大小的范围。

凝胶	胶浓度（%）	线状DNA分子的有效分离范围	溴酚兰*
琼脂糖	0.3	5~60 (kb)
	0.7	0.8~10
	0.9	0.5~7
	1.2	0.4~6
	1.5	0.2~4
	2.0	0.1~3
PAG	3.5	100~2000 (bp)	100
	5.0	80~500	65
	8.0	60~400	45
	12.0	40~200	20
	15.0	25~150	15
	20.0	6~100	12

*指迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小 （核苷酸对）
3、电场强度和电场方向：
低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与所加的电压成正比，通常凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm凝胶。随电场强度增加，高分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增加，使凝胶的有效分离范围缩小。对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5~1.0V/cm电泳过夜，以取得较好的分辨力和整齐的带型。如果电场呈周期性变化，各种分子量的DNA片段为适应新的电场变化所需的时间将不同，分子量越大，则所需的时间越多。因此可以通过脉冲电场凝胶电泳分离极大片段的DNA。
4、电泳环境
缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。Tris-Cl缓冲体系中，由于Cl－的泳动速度比样品分子快得多，易引起带型不均一现象，所以常采用含EDTA的Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）和Tris-磷酸（TPE）三种缓冲体系。传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮液槽之间进行缓冲液循环，并经常更新TAE。TBE与TPE有较高的缓冲能力，现多用，但因TBE中硼酸易与琼脂糖形成复合物，在短时间（≤5h）琼脂糖凝胶电泳时，常用TAE，而在PAGE中常用TBE。双链线状DNA在TAE中迁移速率比TBE或TPE中快将近10%，但各个缓冲体系的分辨能力几乎相同，（对超螺旋DNA，在TAE 中的分辨率比在TBE中的更好）。凝胶电泳后要回收DNA片段，不宜采用TPE缓冲体系，这使DNA片段含较高的磷酸盐、易与DNA一起沉淀，而影响一些酶反应，缓冲液中含EDTA，目的在于螯合二价离子，抑制核酸酶以保护核酸。
缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般在0.02~0.2之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导电性极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。
缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带负电荷，向正极泳动。
在进行电泳时，荧光染料EB可插入到碱基中，从而增加线状和开环DNA的长度，使其刚性更强，并会使线状DNA的迁移率降15%，另外温度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。