DNA的酶切消化与凝胶回收

[实验原理]

限制性内切酶是分子操作中重要的工具酶，是一类能够识别双链DNA分子某种特定的核苷酸序列并切割双链DNA分子的核酸内切酶。可分为3类，Ⅰ和Ⅲ类限制酶兼有甲基化等修饰作用及以来ATP的限制性切割活性，前者结合于识别位点随即切割DNA，后者则在识别位点切割。Ⅱ类限制酶是由两种酶分子组成的复合体系，一种具有限制性内切酶功能，切割某一特定的核苷酸序列，另一种为独立的甲基化酶，可修饰同一识别序列。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4-7个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异，切割DNA后，有的产生平末端，有的产生粘性末端。应用限制酶：

（1）可提供DNA物理图谱的特异性标记；

（2）酶切产生的特异性片段可用于分子克隆；

DNA分子经限制性内切酶消化以后，产生不同大小的DNA片段，我们需要从中分离出所需的目的片段，进一步做亚克隆或用作探针。通过琼脂糖凝胶电泳可以将目的片段与其它DNA片段分开，然后从琼脂糖凝胶中回收含有相应片段的液体，经酚/氯仿处理、乙醇沉淀就可以获得符合要求的DNA片段。

[实验目的]

1、利用限制酶消化质粒载体，掌握DNA限制性内切酶消化反应的原理和方法。

2、掌握DNA片段凝胶纯化和回收的方法。

[实验材料]

酶切的质粒和PCR片段， 1X TBE电泳缓冲液、0.8%琼脂糖凝胶、酚/氯仿、无水乙醇、70%乙醇、3M醋酸钠（pH5.2）、上样缓冲液

[实验仪器]

电泳仪、电泳槽、离心机、紫外透射检测仪

[实验用具]

微量取液器、吸管头、刀片、1.5ml离心管、 0.5ml离心管、镊子、玻璃棉、小针头

[操作步骤]

1、酶切反应

按下表配制酶解混合液，混匀，37℃ 保温2-4小时，加入上样缓冲液终止反应，或－20℃保存。

 

 

10X缓冲液	10μL
质粒ＤＮＡ（pRSETA）	20μL
BamHI	3μL
HindⅢ	2μL
H2O	65μL

 

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2、琼脂糖凝胶电泳

（1）用1 x TAE缓冲液配制琼脂糖凝胶：在电子天平上准确称取琼脂糖0.16g，倒入100mL三角瓶，加入20mL缓冲液。

（2）在微波炉上加热40S。

（3）待冷却至60℃左右时，加入1uL溴化乙啶，摇匀。

（4）将凝胶倒入预先准备好的制胶板上，插入梳子（制备电泳专用），置于室温或4℃冰箱，待冷却。

（5）将酶解液约100微升加入0.8％琼脂糖胶的样品孔中，将DNA分子量标准2微升加入小孔中，然后用80V电压电泳20min。

（6）取出凝胶，在紫外灯下观察，记录观察结果。　

3、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

（1）用小针头在0.5ml离心管底部打洞，用玻璃棉塞住离心管底部。

（2）紫外透射检测仪下观察，用小刀片小心切出含有目的片段的凝胶。

（3）将凝胶条放入0.5ml离心管中，外套1.5ml离心管，5000rpm离心3分钟。用微量取液器吸取1.5ml离心管中的液体，转移到另一干净的1.5ml离心管中。然后重复离心，直到将凝胶条中的液体全部转移为止。

（4）用等体积酚/氯仿抽提。重复二次。

（5）加入0.1倍体积3M醋酸钠及2.5倍体积无水乙醇。然后置-20℃冰箱30min。

（6）4℃条件下，15000rpm离心15min，弃上清液。

（7）用70%乙醇洗沉淀2次。将沉淀风干后，加入10微升H2O溶解沉淀，置-20℃冰箱保存。

[注意事项]

1、切凝胶在紫外灯下操作，应作好防护工作；操作应尽量快，避免DNA在紫外线照射下可能发生的突变。

2、切取含有目的片段的凝胶时，应尽量减少周围凝胶的带入。