DNA的限制性内切酶酶切(restriction endonuclease，RE)分析

【原理】

限制性内切酶(restrictionendonuclease，RE)是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的RE，能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致，可造成RE酶切位点的改变，故当用一定的RE切割时，其切开的片段(分子量)大小与正常人发生差异，即DNA限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的。

实验可选用价格低廉、酶切效果好的EcoRⅠ(识别位点G↓AATTC)对λDNA进行酶切，观察RE的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生分子量分别为21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp和3530bp片段。

本实验是将实验十制备的人Bcl-2重组质粒DNA作为EcoRⅠ酶切底物。人Bcl-2重组质粒是EcoRⅠ单酶切的pBluescriptⅡKS(-)载体与EcoRⅠ单酶切的人Bcl-2cDNA重组而成的，大小为4861bp，前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2961bp的质粒载体。因此用EcoRⅠ酶切则应得到空载pBluescriptⅡKS(-)载体(2.96kb)和人Bcl-2cDNA(1.9kb)两个片段。经琼脂糖凝胶电泳后可较容易鉴定鉴定该质粒中的插入片段。

【试剂】

1．DNA底物λDNA或制备的肝组织DNA或实验十制备的EcoRⅠ非定向克隆构建的人Bcl-2重组质粒DNA。

2．限制性内切酶EcoRⅠ及其缓冲液只需购买国内试剂公司的产品即可，每种RE均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该RE均可获得100%酶切活性。

3．50×TAE电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/LEDTA(pH8.0)20ml，加蒸馏水至100ml。1×TAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。

4．溴酚蓝指示剂溶液(6×上样缓冲液)称取溴酚蓝100mg，加双蒸水5ml，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50ml，加入NaOH1滴，调至蓝色。

5．溴化乙锭(EB，1mg/ml)戴手套谨慎称取EB20mg于棕色试剂瓶中，加20ml双蒸水，溶解后贮于4℃备用，配制琼脂糖凝胶时每100ml凝胶加50μlEB。

6．DNA分子量标准根据需要购买，一般浓度为0.5μg/μl。

【操作步骤】

1．将下列试剂缓冲液2μl，λDNA(5μg)或基因组DNA(5μg)或质粒DNA样品(1μg)，EcoRⅠ5～10U加至0.5mlEP管中，加双蒸水至20μl，加盖，混匀后稍离心，37℃水浴反应1h。

2．制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量，见表。
表琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系

凝胶中的琼脂糖含量[%(w/v)]线性DNA分子的有效分离范围(kb)

0.35～60

0.61～20

0.70.8～10

0.90.5～7

1.20.4～6

1.50.2～3

2.00.1～2
称取0.8g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓冲液100ml，置微波炉或水浴加热至完全熔化，取出摇匀，稍冷却后加50μlEB染色液，摇匀。

3．灌胶

(1)取洁净的电泳内槽(又称托盘)，用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好(一定要封严，不能留缝隙)。

(2)将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。

(3)将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。

(4)待胶凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。

(5)加入1×TAE缓冲液至电泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。

4．加样剪取适当大小的蜡膜(Parafilm膜)，取6×上样缓冲液1μl点于膜上数点。取5μl酶切后的样品，0.5～1μg未酶切质粒DNA，DNA分子量标准分别与上样缓冲液混匀。将其分别加入凝胶的点样孔(记录点样顺序及点样量)。

5．电泳接通电源槽与电泳仪的电源(检查正负极，DNA片段是从负极向正极移动)。DNA的迁移率与电压成正比，电压不超过5V/cm凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿1～2cm处，切断电源，停止电泳。

6．观察结果取出内槽，在紫外分析仪的玻璃平板上小心推出凝胶，通过防护屏或戴防护眼镜观察紫外灯透射的结果，DNA存在处应显出桔红色荧光条带，可观察到酶切与未酶切后的DNA带的泳动位置。

7．摄影在镜头前加一块红色滤光片，使用100o黑白胶卷，利用透射紫外光作光源，光圈2.8，曝光0.5～2s，调准焦距，可拍摄质量较好的凝胶照片。有条件则使用DNA一次成像仪。

【注意事项】

1．本实验可先进行酶切反应，酶切过程等时间的间隙灌好琼脂糖凝胶。

2．进行DNA酶切时，要在其最适温度下(大多数为37℃)进行。最好是用每一种酶的专用缓冲液，以达到最佳酶切效率。如遇2种酶酶切应先用低盐缓冲液后用高盐缓冲液，或一种酶切结束后加TE至400μl，再进行酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，重新建立第二个酶切反应体系。

3．RE一定要在低温(－20℃)下贮存，因含50%甘油，在此温度下一般不会结冰，如结冰则表明冰箱温度低于－20℃，应避免结冰。新购的大包装酶，应先分装。每次吸取后均应将RE管放在冰盒内，用完后立即放在－20℃，每次取酶尽可能使用新的灭菌tip，避免污染。

4．进行大量酶切时，先要确定RE的浓度。一般1URE于37℃条件下作用底物DNA1h以上可切割1μgDNA。一般来说，要用2～3倍才能保证完全消化，对基因组DNA尤其如此。

5．酶切基因组DNA是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到DNA片段呈均一递减的一条区带，则表示酶切完全。

6．对多个样品基因组DNA分别酶切电泳摄影，绘制出多个样品的DNA限制性内切酶图谱，即可分析作出基因诊断。

7．为便于电泳后直接可观察结果，EB可在琼脂糖加热熔化至灌胶前加入。EB是DNA的诱变剂，亦是极强的致癌物，配制和使用过程中要小心，操作时一定要戴手套，用过的手套要及时把手套顺手翻过来，让污染有EB的面朝里，有EB的废液和器皿要分别处理好。