作者：中华医学网发布时间：2017-10-13 15:24浏览：
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一、实验目的
本实验学习、了解限制性内切酶的特性，学习根据具体目的设计适当的酶切体系并实施之。
二、实验原理
利用限制性内切酶切割DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的酶切为后续工作提供了有效的实验材料。限制性内切酶是细菌体内限制修饰系统内部切断的内切酶。根据限制性内切酶的特性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型。本实验使用其中的Ⅱ型酶对DNA分子进行切割，并得到粘性末端或平末端。
限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位（1Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。
在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。
三、材料、试剂及器具
1、材料
（1）标准质粒样品Puc19
（2）自提质粒样品Puc19
2、试剂
（1）EcoR I及其缓冲液(10U/μg)：
Tris HCL或 KCL;DTT(Dithothreitol)二硫苏糖醇；BSA（小牛血清蛋白）；Mg2+甘油。
3、器具
恒温水浴锅
四、操作步骤
取质粒样品于0.5ml离心管中，按照表39-1加入试剂
↓
混匀；4000rpm离心30s,甩至管底
↓
37℃,保温2h酶切
↓
65℃，保温20min使酶失活
↓电泳
用紫外投射仪检测
↓
-20℃保存待用
表39-1 酶切反应成分（单位：μl）
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反应1（标准Puc19） 反应2（自提Puc19） |
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| DNA样品 | 10 | 10 |
| 酶切缓冲液 | 1.5 | 1.5 |
| EcoR I | 1.0 | 1.0 |
| 无菌水 | 2.5 | 2.5 |
| 总体积 | 15 | 15 |
五、注意事项
1、酶切反应体系依不同的酶、不同的酶切目的而异。
2、37℃保温一段时间后可取少量样品电泳检测。若已达到酶切目的可结束反应。
3、使用加热使酶失活应视限制性内切酶的特性而异；也可使用EDTA使酶失活。
六、实验结果
1.DNA 相对分子量标准物（marker);
2.pUC19 质粒 DNA 经EcoRⅠ 完全酶切；
3.pUC19 质粒 DNA 经EcoRⅠ 部分酶切；
4.自提pUC19 质粒 DNA （此效果提得较好，为1带，以超螺旋质粒DNA为主。有时是3条带，分别为超螺旋质粒，线状质粒和开环质粒。还有时结果为2条带）