DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组的载体-2

二、噬菌体载体
作为细菌寄生物的噬菌体，大多数具有编码多种蛋白质的基因，能利用宿主细胞的蛋白质合成体系，进行生长和增殖。构建的噬菌体载体，以λ噬菌体、M13和粘粒最为常用。
㈠ λ噬菌体载体
野生型λDNA是一种基因组为4.8 kb的线性双链DNA，全部序列已知，共编码50多个基因。其中约一半基因参与了噬菌体的生命周期活动，称为必需基因；另一部分基因，当被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能。另外，在分子两端各有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，称cos位点。
野生型的λ噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体，即既能进入溶菌性生命周期又能进入溶源性生命周期。λ噬菌体感染细菌后，λDNA通过粘性末端而环化。既可溶菌性生长（裂解），即λDNA在宿主中多次复制并合成大量基因产物，装配成噬菌体颗粒，最后裂解宿主菌；又可以溶源性生长，即λDNA整合到宿主染色体基因组DNA中，与之一起复制并遗传给子代，但宿主细胞不被裂解。裂解途径和溶源途径的选择取决于宿主与噬菌体之间的许多因素的相互作用，以及噬菌体基因组的精确调控。
λ噬菌体具有二个重要特征，使之成为一类重要的、很有价值的基因克隆载体。①除必需基因外的功能相关（溶源生长和重组）基因成簇排列在一起位于中间部分，约占全基因组的30%，不是溶菌生长所必需的。因此，该区可缺失或作外源DNA的插入区。②噬菌体颗粒成熟的包装过程（外壳蛋白包装DNA），只要重组DNA不小于野生型λDNA全长75%和大于105%，均可被包装成具有噬菌体活性的成熟颗粒。因此大约可插入长达15kb的外源DNA。
当外源DNA片段克隆到插入型载体上，噬菌体便丧失某些生物学功能，即插入失活效应。又可分为免疫功能失活的和β-半乳糖苷酶失活的两种亚型。①免疫功能失活的插入型载体。插入位点位于基因组中的免疫编码区，外源DNA片段插入后，就会使载体合成阻遏蛋白的能力被破坏，导致不能进入溶源生长周期。因此凡有外源DNA插入的λ重组体都会形成清晰的噬菌斑，而未有外源DNA插入空载体则形成混浊的噬菌斑。这种形态上的差别，为分离阳性重组体提供了方便的选择标记。②大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活型载体。插入位点位于基因组中的β-半乳糖苷酶（LaZ）编码区，因此可通过蓝白斑实验筛选。对于替换型载体，当外源DNA插入时，一对克隆位点间的基因组DNA被替换（取代），从而丧失某些生物学功能，造成重组体与空载体形成噬菌斑形态（清晰和混浊）或颜色（蓝白斑实验）差别，这种差别即可作为筛选标记。
这两类λ噬菌体载体具有不同的特点，在基因克隆中的用途也不尽相同。插入型载体只能容纳较小分子的外源DNA片段（一般在10kb以内），广泛用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可容纳较大分子的外源DNA片段，可用于高等生物染色体DNA片段克隆。但不管是哪种类型，体外重组体DNA分子，其大小应不小于野生型λDNA的75%和不大于105%，否则不能包装成有活性的噬菌体颗粒。
λ噬菌体载体结构举例说明。

λgt10（插入型）和Charon 40（替换型）结构示意

㈡ 粘粒载体
粘粒又称柯斯质粒（cosmid），“cosmid”一词是“cos site-arrying plasmid”的缩写，其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。粘粒载体由质粒和λ噬菌体的cos粘性末端构建成而成。其质粒DNA部分是一个完整的复制子，包括复制起始位点、一个或多个酶切位点和抗菌素抗药性基因（Ampr和/或Tetr），因此粘粒也能象质粒一样用标准的转化方法导入大肠杆菌和进行筛选；其λ噬菌体片段带有一个将DNA包装到λ噬菌体颗粒中所需的序列，除了cos粘性末端之外，在其两端还具有与噬菌体包装有关的短序列，故又能被包装成具有感染性的噬菌体颗粒。很明显粘粒兼具了质粒和噬菌体二者的优点。
目前已经发展出了许多不同类型的粘粒载体，例如c2XB、pHC79、pTL5、pJC74、pJC720、pJB6和pJB8等。粘粒载体大体上有以下四方面的特点：
1．具有λ噬菌体的特征 粘粒载体在体外克隆了适当长度的外源DNA并被包装成噬菌体颗粒之后，可以似λ噬菌体一样高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞的粘粒DNA分子，便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化并进入溶源周期。但由于不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。
2．具有质粒载体特征 粘粒载体有质粒复制子，因此在寄主细胞内亦能象质粒DNA一样进行复制，并且在氯霉素作用下也能获得进一步的扩增。另外，粘粒载体还通常具有抗菌素抗性基因，可作为重组体分子的筛选标记。
3．具有高容量的克隆能力 粘粒载体仅含一个复制起始位点、一二个选择标记和cos位点三个部分，其本身大小仅为5～7kb。因此插入外源DNA片段可大到45kb。这一装载容量比λ噬菌体载体和质粒载体要大得多。
4．具有与同源序列的质粒进行重组的能力 粘粒载体能与共存于同一寄主细胞中的带有共同序列的质粒进行重组，形成共合体。当一个粘粒载体与带有不同抗药性标记的质粒转化同一寄主细胞时，便可筛选到具有相容性复制起点的共合体分子。
粘粒载体pJB8

㈢ 单链丝状噬菌体载体
大肠杆菌的丝状噬菌体包括M13噬菌体、f1噬菌体和fd噬菌体，其基因组都是一个长度6.4kb且彼此同源性很高的单链闭环DNA分子。下面以M13为例简要介绍单链丝状噬菌体载体的特点。
M13噬菌体颗粒外形成丝状，是一种既不溶源也不裂解宿主细胞的噬菌体。其感染型是单链DNA（＋链），感染宿主（通常是大肠杆菌）后，借助宿主的酶系统，先将单链DNA复制为双链DNA（复制型），复制型在菌体内继续增殖，可达200拷贝。感染的细胞能够继续生长和分裂，每个细胞每个世代可释放出1 000个左右的子代噬菌体颗粒。因此培养基中可收集到大量的M13噬菌体颗粒。
通过对M13噬菌体进行改造，已成功地发展出了M13mp噬菌体载体系列，例如M13mp8、M13mp9和M13mp10、M13mp11等。M13mp系列都是从同一个重组体（M13mp1）改造而来的，在M13主要基因间隔区插入了带有大肠杆菌LacZ的调控序列和N端头146个氨基酸的编码信息，且在其中插入了多克隆位点序列。因此重组体也可用IPTG-X-gal蓝白斑实验进行筛选；M13mp系列大多是成对的，且有pUC质粒系列的多克隆位点与之对应。