目的基因的亚克隆（subcloning）-1

所谓亚克隆就是对已经获得的目的片段进行重新，其目的在于对目的进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚的基本过程包括：(1)目的片段和载体的制备； (2)目的片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。

一、试剂准备

1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。

2．1.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。

3．IPTG、X-Gal

4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。

5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。

6．限制性核酸内切酶、T4 连接酶。

二、目的片段和载体的制备

选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的和载体，获得线性，用于重组。根据目的和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。在亚时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。（实验操作同前述）

三、利用T4 连接酶 进行目的片段和载体的体外连接

 

 

外源片段末端性质	连接要求	连接结果
不对称粘性末端	两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率	载体与外源连接处的限制酶切位点常可保留；非重组的背景较低；外源可以定向插入到载体中。
对称性粘性末端	线形载体常需 磷酸酶脱磷处理	载体与外源连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源的串联拷贝；外源会以两个方向插入到载体中。
平端	要求高浓度的和连接酶	载体与外源连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源的串联拷贝；非重组的背景较高 。

（一）连接要求和结果

带有相同末端(平端或粘端)的外源片段必须到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体的自身环化。利用T4 连接酶进行目的片段和载体的体外连接反应，也就是在双链 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。

（二）T4 连接酶对目的片段和载体连接的一般方案

1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。

2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源 分子（一般线性载体分子与外源分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。

3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。

4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃水浴）连接8-14hr。