在质粒载体(plasmid vector)中进行平末端片段的克隆

1、分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1－10μg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。
2、苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。
3、分别用TE（pH 8.0）重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100 ng/ml。假设1 bp相当于660Da，计算DNA的终浓度（pmol/ml）。
4、将载体DNA去磷酸化。
5、按下表将适量的DNA转移至无菌的0.5ml离心管：

 

管号	DNA
A 和E	载体1 [60fmol (~100ng)]
B	外源插入片段2 [60fmol (~10ng)]
C 和F	载体1 （60fmol）和外源插入片段3 （60fmol）
D	线状载体（5’-磷酸化）（60fmol）
G	环状载体[60fmol (~10ng)]

¹ 载体DNA 已进行去磷酸化
² 外源目的 DNA 可以连接接头。

3 连接反应中，质粒载体和插入的DNA 片段摩尔比一般为1：1。DNA 的总浓度应约为10ng/μl。

 

（1）A、B和C管中加入：
10×连接缓冲液 1.0μl
T4噬菌体连接酶 0.5 Weiss单位
5 mmol/L ATP 1.0μl
H2O 补至8.5μl
30%PEG 8000 1~1.5μl

（2）D、E和F管中加入：

10×连接缓冲液 1.0μl

5 mmol/L ATP 1.0μl

H2O 补至8.5μl

30%PEG 8000 1~1.5μl

不加DNA 酶

6．连接反应体系置于16℃水浴温育过夜或20℃水浴温育4 h。

7．用每份稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。转化时，应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒DNA 作为对照，以检查转化效率。

作为对照，以检查转化效率。

管号	DNA	连接酶（有/无）	预期转化克隆数
A	载体1	+	~03
B	插入片段	+	0
C	载体1 和插入片段	+	比F管高5倍
D	载体1	-	~0
E	载体2	-	比D管高50倍
F	载体和插入片段	-	比D管高50倍
G	环状质粒	-	2×105

¹ 去磷酸化
² 未去磷酸化

3 如果出现来自去磷酸化的载体DNA 自身连接产物的转化子，是由于用碱性磷酸酶处理时未能除尽5’端的磷酸基。