PCR扩增产物的克隆技术-2

T－载体的构建

一：仪器：同质粒DNA提取实验、酶切实验及RT－PCR实验

二：试剂：SmaI、其余同质粒DNA提取实验、酶切实验及RT－PCR实验

三：操作：

1：提纯载体DNA

2：将1ug提纯的PGEMDNA用SmaI1ul进行全酶切（为了切割彻底、甚至能破坏酶切位点周围碱基序列而防止自连发生，酶可过量使用，并在25℃过夜）

2：酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥复溶

3：在上述酶切反应后复溶的含1ugDNA的Eppendof管中加入

10× PCR缓冲液 5ul

10mM dTTP 10ul

1mg/mlBSA 10ul

5U/ul Taq酶 0.5ul

加水至50ul

70℃2小时，酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥复溶

此载体即可直接用于PCR产物的克隆。

PCR产物的T－载体克隆

一：仪器

同连接、转化实验

二：试剂

T－载体，其余同连接、转化实验

三：操作：

1:PCR产物的纯化见上

2：PCR产物的克隆用自制或购置的T－载体按下述比例进行连接反应

反应体系 阴性对照体系 背景对照体系

10×T4DNA连接酶缓冲液 1 1 1

T－载体1 1 1

PCR产物 X(计算见附) 0 0

阴性对照DNA（500bp 4ng/ul ） 0 2 0

T4DNA连接酶（3u/ul） 1 1 1

加水至10ul

3：4℃过夜

4：T－载体与外源片断连接后的转化见实验二二与二三
附：连接反应中PCR产物用量的确定

1：待重组片断与载体间的最佳分子比

T载体与待克隆的对照DNA间的最佳分子比为1:1。一般分子比从1:8到8:1都是适合的。如果在实验开始前,没有确定载体与待克隆片断间的最佳分子比,那么有必要在实验时将最佳比给确定下来。3:1-1:3的比值在大多数情况下都能得到较好的实验结果。PCR扩增后的片断其浓度在实验时也必须确定,确定其浓度的方法为或通过凝胶电泳后对待测片断与一系列成梯度的已知浓度的DNA相比较而确定,或可通过比色法确定。

2：连接反应中待扩增片断的用量可通过下列公式计算

X=A×B×D/C

a=载体的ng数、b=待克隆片断的碱基数Kb、c=载体碱基数Kb

d=待克隆片断与载体分子比（根据附1确定）、x=连接反应中待扩增片断的用量

3用pGEMR-T系列载体系统生成单链DNA方法

要诱导单链DNA的生成,应用特定的辅助嗜菌体去感染含pGEMR-T或pGEMR-T Easy载体的菌体。质粒进入f1嗜菌体的复制区,使得单链DNA象存在于包装蛋白内的病毒颗粒一样被分泌出来。这种单链DNA很容易通过沉淀和抽提方法加以提取和纯化。

注：1：在室温下,缩短保温时间,也可能是有效的操作方法,但这有可能降低克隆数。最适的连接条件为4℃过夜，因PCR产物与T－载体间的配对碱基少，高温不利于连接的进行。经验表明如连接反应高于15℃，则兰斑数大大升高，可能T载体中存在没有加上T的载体，高温下平端自连的比例增加。

2：连接酶最好用相关的经修饰纯化的T4DNA连接酶,因其他连接酶可能具核酸外切酶的活性,这样如用这种酶就有可能导致对载体3’T产生切割。

3：T4DAN连接酶的10×缓冲液中含ATP,在温度频繁波动时,此成分有可能被降解,因此要避免仅为了少量使用而对缓冲液反复冻融。如果在融化后的T4DAN连接酶10×缓冲液中出现沉淀,则应将此缓冲液振荡,以使沉淀复融。

4：重组T载体转化时最好用SOC培养基,LB培养基也能用,但转化数可能低。

5：因含β半乳糖苷酶的菌落生长速度慢于无此酶活的菌落,因此保温过夜后,蓝斑菌落要远小于白斑菌落,白斑菌落的直径近1毫米。

PCR产物的平端克隆

仪器：同上

试剂：SauI,Klenow片段,T4连接酶

操作：载体提取后用过量SmaI切割，提取、纯化

PCR反应液加热到99℃10 min，灭活Taq酶，补镁离子到5-10mM加入1u Klenow片段，70℃15min。纯化

载体与PCR产物以1：10比例16℃连接过夜

PCR反应液可直接用于连接，但最好对PCR产物纯化后进行连接，既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。