基因工程的载体和工具酶-3

2.M13噬菌体载体的构建

 

⑴ 在IS区内插入LacZ基因 ⑵在标记基因区内组装MCS区段

所以能通过a互补在X-Gal/ IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等

这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。

（三）柯斯质粒载体

1.柯斯质粒载体的特点

柯斯质粒是一类人工构建的含有lDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。

柯斯质粒的大小为4-6kb，

由3部分组成：

A.多克隆位点区

B. 含有cos位点的lDNA区

C. 复制起始位点和抗性标记区

2.柯斯质粒载体的特性

1、具有l噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。

2、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。

3、高容量的克隆能力 cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达45kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb。

四种常用载体的比较

	质粒	λ噬菌体	柯斯质粒	单链噬菌体
克隆DNA大片段	±*	+	+	-
构建基因组文库	-	+	+	-
构建DNA文库	+	-	-	-
常规的亚克隆化	+	-	-	-
构建新型的DNA结构	+	-	-	-
序列分析	+	-	-	+
单链探针	+**	-	-	+
外源基因在大肠杆菌中的表达	+	-	-	-

第二节基因操作的工具酶

一、限制性核酸内切酶及其应用

（一）限制性核酸内切酶的发现

当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 Eco核酸酶不能识别已甲基化的序列。B

最早分离出的限制内切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，没有实用价值。

首个II型限制内切酶是在1970年，由H.O.Smith等从Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。

从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的 。

限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5－磷酸二酯键。

（二）限制性核酸内切酶的分类

分为I型、II型和III型。

（三）限制性核酸内切酶的命名

1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体

字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为Hin；

2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；

3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hin。d III

（四） II型限制性核酸内切酶的基本特性

1、识别位点的特异性

每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。

2、识别序列的对称性

靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。

3、切割位点的规范性

交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。