Southern印迹杂交实验原理和方法-2

（一） 细管虹吸印迹法
此法是利用浓盐酸转移缓冲液的推动作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，转移方式见图10－1：
容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜或尼龙膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动而滞留在膜上。
步骤：
1． 20×SSC浸湿一张whatman 3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个“桥”。
2． 凝胶反放在浸湿的whatman 3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。
3． 照凝胶的大小剪一张尼龙膜。
4．膜放在凝胶上。
5． 尼龙膜上放一张whatman 3mm滤纸、一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。
6．20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。

7． 以下方法把DNA固定在膜上：
（1） 紫外交联：
1） 把膜（DNA面朝上）放在用2×SCC浸湿的whatman 3MM滤纸上
2） 把湿膜暴露在短波紫外光（254nm）下1～3分钟 。
3） 在无菌双蒸水中浸润膜。
4） 空气中凉干膜。
（2） 干燥：
1） 在2×SCC中短暂洗膜。
2） 120℃30分钟干烤固定或80℃2h干烤固定。
8. 如果不立即进行下一步杂交反应，则可把膜保存在两张whatman 3mm滤纸之间，放在密封袋中4℃保存。

图 10-1细管虹吸印记法

（二） 电转移法
此法是通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本方法是将滤膜与凝胶贴在一起，并将凝胶与滤膜一起置于滤纸之间，固定于凝胶支持夹，将支持夹置于盛有转移电泳缓冲液的转移电泳槽中，凝胶平面与电场方向垂直，附有滤膜的一面朝向正极。在电场的作用下凝胶中的DNA片段向与凝胶平面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，滞留在滤膜上形成印迹。该法具有简单、快速、高效转移DNA的特点，尤其适用于用毛细管虹吸转移不理想的大片段DNA。一般只需2-3h至多6-8h即可完成转移过程。但应用这种方法需注意：不能选用硝酸纤维素膜作为固相支持物；应用循环冷却水装置以保证转移缓冲液温度不会太高；转移缓冲液不能用高盐缓冲液，以免产生强电流破坏DNA。
具体步骤如下：
1. 将凝胶浸泡于1×TBE或TAE中。
2. 准备好电转移装置的凝胶支持夹裁剪4张与凝胶大小相同的Whatman 3mm滤纸和一张尼龙膜浸泡于1×TBE或TAE中。
3. 依次将凝胶、尼龙膜、滤纸和海绵垫叠放在凝胶支持夹中，各层之间不能有气泡滞留。
4. 将凝胶支持夹安放在充满1×TBE或TAE的电转仪中。
5. 尼龙膜一侧置正极，凝胶一侧置负极，300～600mA恒流，4～8h，循环水冷却或置冷室中。
6. 电转移完毕，尼龙膜用1×TBE或TAE漂洗，用干燥滤纸吸干，80℃真空烘烤2h或短波紫外照射固定备用。
（三） 真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到置于凝胶下面的因相支持物上——尼龙膜或硝酸纤维素膜上。