作者：中华医学网发布时间：2017-10-13 11:13浏览：
次
⑦60伏电泳过夜。
⑧取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。
⑨室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/l NaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。
⑩室温下将胶浸到0.1mol/L Tris·HCl (Ph7.5)中45min，使胶中和。
⑾20×SSC洗胶1h。
⑿20×SSC中过夜，转印到硝酸纤维素膜上。
⒀取出硝酸纤维膜，80℃真空烘烤2h。
5．组织原位杂交（Tissue in situ hybridization） 组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置；对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布；与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。此外，原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。
用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以是RNA探针。通常探针的长度以100～400nt为宜，过长则杂交效率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（16～30nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针。因此，寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交的优选探针。
探针的标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。放射性同位素中，3H和35S最为常用。3H标记的探针半衰期长，成像分辨率高，便于定位， 缺点是能量低。35S标记探针活性较高，影像分辨率也较好。而32P能量过高，致使产生的影像模糊，不利于确定杂交位点。
原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素，标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/l HCl处理载玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水，原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性和稳定性上还需要进一步完善和提高（详见二十章）。
6．固相夹心杂交
Dunn等最早介绍了夹心杂交类型，Ranki等又作了进一步的改进。夹心杂交法比直接滤膜杂交法有两个主要的优点：①样品不需要固定，对粗制样品能做出可靠的检测；②用夹心杂交法比直接滤膜杂交法特异性强，因为只有两个杂交物都杂交才能产生可检测的信号。
固相夹心杂交需要两个靠近而不互相重叠的探针，一个作固相吸附探针，另一个作标记检测探针。样品基因组内核酸只有使这两个探针紧密相连才能形成夹心结构。需注意的是两个探针必须分别亚克隆进入两个分离的非同源载体内，以避免产生高的本底信号（如一个克隆人Puc19,另一克隆人pBR322）。
夹心杂交法可用滤膜和小珠固定吸附探针，使用小珠可更好地进行标准化试验和更容易对小量样品进行操作。Dahlen 等利用微孔板进行夹心杂交，可同时进行大量样品检测，他们先吸取DNA探针加到凹板中，然后用紫外线照射使其固定到塑料板上。用微孔板进行夹心杂交还可直接用于PCR技术。应用光敏生物标记探针检测PCR产物的敏感性和用32P标记探针（3×108cpm/μg）作16h放射自显影的Southern杂交的敏感性一样。用微孔板杂交的其它优点还包括同时做多份样品，加样、漂洗和读结果等步骤可以自动化。
7．其它杂交类型
（1）固化探针杂交：该法较少使用，原理是使未标记固化探针通过杂交与靶RNA或DNA结合，漂洗后，用酶标抗DNA：RNA抗体或抗 DNA：DNA抗体与杂交物结合。将乳胶颗粒收集，吸附到膜上后漂洗，加入底物显色并进行测定。探针浓度2μg/ml,80℃杂交，可在10～15min 完成，检测的敏感性为5×108靶序列。
（2）反向杂交：这个杂交类型是用标记的样品核酸与未标记的固化探针DNA杂交，故称为“反向杂交”。这种杂交方法的优点是在一次杂交反应中，可同时检测样品中几种核酸 。这种杂交方式主要用于进行中的核酸转录试验和多种病原微生物的检测。前者是在转录过程中标记RNA探针，后者可用光敏生物素制剂BPA标记样品核酸。
（三）液相核酸分子杂交类型
1．吸附杂交
（1）HAP吸附杂交：羟基磷灰石（HAP）层析或吸附是液相杂交中最早使用的方法。在液相中杂交后，DNA：DNA杂交双链在低盐条件可特异地吸附到HAP上。通过离心使吸附有核酸双链的HAP沉淀，再用缓冲液离心漂洗几次HAP，然后将HAP置于计数器上进行放射性计数。
（2）亲合吸附杂交：生物素标记DNA探针与溶液中过量的靶RNA杂交，杂交物吸附到酰化亲合素包被的固相支持物（如小球）上，用特异性抗 DNA：RNA杂交物的酶标单克隆抗体与固相支持物上的杂交物反应，加入酶显色底物，这个系统可快速（2h）检测RNA。
（3）磁珠吸附杂交：Gen – probe公司最近应用吖啶翁酯（acridinium ester）标记DNA探针，这种试剂可用更敏感的化学发光来检测。探针和靶杂交后，杂交物可特异地吸附在磁化的有孔小珠（阳离子磁化微球体上）。溶液中的磁性小珠可用磁铁吸出，经过简单的漂洗步骤，吸附探针的小珠可用化学发光测定。
2．发光液相杂交
（1）能量传递法：Heller等设计用两个紧接的探针，一个探针的一端用化学发光基团（供体）标记，另一个探针的一端用荧光物质标记，并且这两个探针靠得很近。两个靠得很近的探针用不同的物质标记（标记光发射），当探针与特异的靶杂交后，这些标记物靠得很近。一种标记物发射的光被另一种标记物吸收，并重新发出不同波长的光，调节 检测器使自动记录第二次发射光的波长。只有在两个探针分子靠得近时，才能产生受激发光，因此这种方法具有较好的特异性。
（2）吖啶翁酯标记法：吖啶翁酯标记探针与靶核酸杂交后，未杂交的标记探针分子上的吖啶翁酯可以用专门的方法选择性除去，所以杂交探针的化学发光是与靶核酸的量成比例的。该法的缺点是检测的敏感度低（约1ng的靶核酸），仅适用于检测扩增的靶序列，如rRNA或PCR扩增产物。
3．液相夹心杂交
（1）亲合杂交：在靶核酸存在下，两个探针与靶杂交，形成夹心结构，杂交完成后，杂交物可移到新的管或凹孔中，在其中杂交物上的吸附探针可结合到固相支持物上，而杂交物上的检测探针可产生检测信号。用生物素标记吸附探针，用125I标记检测探针，这个系统的敏感性可检测出4×106靶分子。该试验保持了固相夹心杂交的高度特异性。
（2）采用多组合成探针和化学发光检测：第一类探针是未标记的检测探针和液相吸附探针，它们有50个碱基长，其中含有30个细菌特异序列碱基和20 个碱基的单链长尾；第二类探针是固相吸附探针，它可吸附在小珠或微孔板上。未标记检测探针的单链长尾用于结合扩增多个标记探针，液相吸附探针和靶杂交物从溶液中分离并固定在小珠或微板上，典型的试验可用25个不同的检测探针和10个不同的吸附探针。第一个标记检测探针上附着很多酶（碱性磷酸酶或过氧化物酶）可实现未标记检测探针的扩增。使用化学发光酶的底物比用显色反应酶的底物更敏感。这个杂交方法已用于乙肝病毒、沙眼衣原体、淋球菌以及质粒抗性的检测，敏感性达到能检测5×104双链DNA分子。
4．复性速率液相分子杂交 这个方法的原理是细菌等原核生物的基因组DNA通常不包含重复顺序。它们在液相中复性（杂交）时，同源DNA比异源DNA的复性速度要快。同源程度越高，复性速率和杂交率越快。利用这个特点，可以通过分光光度计直接测定变性DNA在一定条件下的复性速率，进而用理论推导的数学公式来计算DNA-DNA之间的杂交（结合）度。