DNA重组（DNA recombination）技术：DNA序列测定-1

目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法（双脱氧链终止法）和Maxam（1977）提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都同样生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种（或多种）特定的残基，形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。
高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是DNA序列测定技术的重要基础，可分离仅差一个核苷酸、长度达300~500个核苷酸的单链DNA分子。DNA序列测定的简便方法为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。
除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。此外，新的测序方法亦在不断出现，如上世纪90年代提出的杂交测序法（sequencing by hybridization，SBH）等。

一、双脱氧末端终止法测序
㈠ 原理
双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的基础上发展而来的。其原理是：利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一个羟基（2′,3′-ddNTP）（图7-17），可以通过其5′三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯键。因此，正在增长的DNA链不再延伸，使这条链的延伸终止于这个异常的核苷酸处。这样，在4组独立的酶反应体系中，在4种dNTP混合底物中分别加入4种ddNTP中的一种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。

脱氧核苷三磷酸和双脱氧核苷三磷酸分子结构
㈡ 模板
有两种类型的DNA模板可以作为Sanger法测序的模板，即纯化的单链DNA和经热变性或碱变性的双链DNA。
1．单链DNA模板 在一般情况下，可将靶DNA片段克隆于M13mp载体，从重组克隆M13mp系列噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA模板。这种单链模板效果最佳，只要细心掌握模板与引物的最佳比例，有经验的测序人员通过一次末端终止反应，能读取500个以上的核苷酸序列。
2．经热变性或碱变性的双链DNA模板 尽管采用变性双链DNA作测序模板显然简单且方便，但实际上很难获得单链模板那样的满意结果。利用双链质粒模板测序，其中有两个至关重要的因素，即模板的质量和聚合酶的种类。用小量制备的质粒DNA来测定未知序列的DNA克隆往往因为有污染而并不可取，高纯度的质粒最好采用氯化铯-溴乙锭梯度平衡超速离心法制备。其次是应采用高质量的聚合酶。一次末端终止反应亦可能读出300核苷酸序列。应该注意的是，适合做双链模板的质粒，最好具有较高的拷贝数并有插入失活的选择标志，有配套的通用引物结合区。最常用的载体系统是pUC系列、pGEM系列及Bluescript系列等。双链模板测序最大的优势是对已知序列DNA的亚克隆进行鉴定，可省略再经M13载体亚克隆获取单链模板过程。
㈢ 引物
酶法测序反应中都有一个与模板链特定序列互补的合成的寡核苷酸作为DNA合成的引物。不管是将靶DNA片段克隆于M13mp载体获取的单链DNA作模板，还是采用变性双链DNA（如变性质粒DNA）模板，都有可以与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物（universal primer）可用，而不必另行设计与未知DNA序列互补的引物。适合于M13mp系列载体的通用引物一般长15~29个核苷酸，当然这些引物也同样适用于那些克隆于pUC系列质粒的DNA进行双链测序。这些测序用的通用质粒及其通用引物可直接从许多厂商购买到。
㈣ DNA聚合酶
如前所述，选用合适的DNA聚合酶进行测序反应也是保证测序质量的重要因素之一。常用于双脱氧末端终止法测序的有几种不同的酶：
1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段） 此酶是最早用于建立Sanger测序的酶。但通常会有两个问题：①Klenow片段的持续合成能力较低，通常只能得到约250~350个核苷酸的序列，而且由于聚合酶随机从模板上解离而终止链延伸，通常会产生较高的本底和假带；②对同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域复制效能低下。但此酶价格便宜，对已知序列的亚克隆进行鉴定仍有应用价值。
2．测序酶（sequenase） 该酶是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，其原来很强的3′→5′外切酶活性，经化学修饰后大部分被消除。目前常用的测序酶大都是基因工程产品，完全缺失3′→5′外切酶活性，具有活性非常稳定可靠、持续合成能力强和聚合速度高等优点，是测定较长DNA的首选酶。市售的各种以该酶为基础的测序试剂盒，效果甚佳。
3．耐热DNA聚合酶 PCR技术的应用正在不断扩大，耐热DNA聚合酶应用于以Sanger双脱氧链终止法为基础的DNA测序方案，已发展成为被称为“循环测序”或“线性扩增测序”方法。在该类测序方法中，由于使用了耐热DNA聚合酶，与其他DNA聚合酶相比较具有二大优点。其一，由于采用热循环方法线性扩增模板DNA，获得清晰可辨的序列梯带所需要的模板DNA量少；其二，由于，耐热DNA聚合酶可在95℃高温下保持稳定，测序反应可以在高温（70~80℃）下进行。因而能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的影响。因此，循环法可以方便地对PCR产物、质粒DNA、λDNA和粘粒DNA等双链模板进行序列测定，特别有利于对高GC碱基含量的模板测序。
循环测序法利用了热循环仪的自动循环的高效能力。循环测序反应与普通PCR反应有所不同。只需一条引物，通过单引物进行热循环，模板DNA以线性方式被扩增，而不是标准PCR的指数方式扩增；反应底物除四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，还加入了双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），进行扩增时，链的延伸终止于掺入ddNTP的位置，产生分别终止于不同核苷酸的一系列不同长度的扩增片段。
㈤ 放射性标记
传统的DNA测序方法都采用α-32P-dNTP作为放射性标记物，但由于32P发射的高能β射线，常会引起二个问题。首先是导致放射自显影图谱条带扩散、分辨率低，限制了识读序列的数量和准确性。其次是32P衰变会导致DNA样品分解，通常都应在测序反应后24h内进行电泳，否则无法获得好的结果。
近年来α-35S-dNTP被广泛采用，是由于35S产生较弱的β射线，克服了32P的二大缺点。放射自显影图谱具有较高的分辨率和较低的本底，测序反应产物可在-20℃保存一周，而分辨率并不下降。
㈥ 关于DNA序列的识读
DNA序列的识读是一个熟能生巧的过程。注意几点技巧：①在显影前后一定要注意标明模板名称、日期和测序人等，并标明各套反应位置；②识读时从显而易见的特征序列开始，如连续的同聚核苷酸（如TTTTT、AAAAA）或交替出现的嘌呤和嘧啶（如GTGTGTGT），一旦找到这种序列，便可较快地确定目的序列的位置。

二、Maxam-Gilbert化学降解法测序
几乎在双脱氧法发展的同时，1977年Maxam-Gilbert等提出了化学降解法。自Maxam-Gilbert初次提出以来，其实验方案基本上没有变化。
㈠ 原理
化学降解法与包括合成反应的链终止法不同，需要对原DNA进行化学降解。其基本原理是，首先对待测DNA末端进行放射性标记，再通过5组（也可以是4组）相互独立的化学反应分别得到部分降解产物，其中每一组反应特异性地针对某一种或某一类碱基进行切割。因此，产生5 组（或4组）不同长度的放射性标记的DNA片段，每组中的每个片段都有放射性标记的共同起点，但长度取决于该组反应针对的碱基在原样品DNA分子上的位置。此后各组反应物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，通过放射自显影检测末端标记的分子，并直接读取待测DNA片段的核苷酸序列。测序原理如图7-19所示。

图7-19化学裂解法测序原理

㈡ 待测DNA的末端标记
化学降解法测序首先要制备单侧末端标记的待测DNA片段。DNA片段的核素标记有三种方法：
1．利用T4噬菌体多核苷酸激酶和γ-32P-ATP标记DNA的5ˊ-末端 对于去5′-磷酸化的DNA片段，T4噬菌体多核苷酸激酶可以通过正向反应将γ-32P-ATP的γ-磷酸基转移至DNA的5ˊ-末端；对于5′-磷酸化的DNA片段，在过量ATP条件下，该酶可以通过交换反应将γ-32P-ATP的γ-磷酸基与DNA的5ˊ-末端磷酸基发生交换反应而标记。但对于双链DNA片段，由于DNA的两侧均被标记，不能直接用于测序反应。需要经限制性内切酶切割，电泳分离二种不同大小的标记片段，或者直接用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离二条单链，但这种分离方法比较困难，较少使用。