第二代测序技术：高速发展的高通量测序技术-1

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。

自从2005年454 Life Sciences公司（2007年该公司被Roche正式收购）推出了 454 FLX焦磷酸测序平台（454 FLX pyrosequencing platform）以来，曾推出过3730xl DNA测序仪（3730xl DNA Analyzer）的Applied BioSystem（ABI）这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了，因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列（series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了两个强有力的竞争对手，一个就是罗氏公司(Roche)的454 测序仪(Roch GS FLX sequencer)，，另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台（Genome Analyzer platform），为此，2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。（见表一）

 

公司名称	技术原理	技术开发者	商业模式
Apply Biosystems(ABI)	基于磁珠的大规模并行克隆连接DNA测序法	美国Agencourt私人基因组学公司（APG）	上市公司： 销售设备和试剂获取利润
Illumina	合成测序法	英国Solexa公司首席科学家David Bentley	上市公司： 销售设备和试剂获取利润
Roche	大规模并行焦磷酸合成测序法	美国454 Life Sciences公司的创始人Jonathan Rothberg	上市公司： 销售设备和试剂获取利润
Helicos	大规模并行单分子合成测序法	美国斯坦福大学生物工程学家Stephen Quake	上市公司：2007年5月首次公开募股（IPO）
Complete Genomics	DNA纳米阵列与组合探针锚定连接测序法	美国Complete Genomics公司首席科学家radoje drmanac	私人公司：投资额为4650万美元

 

表一：主流测序平台一览

这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取40万到 400万条序列。读取长度根据平台不同从25bp到450bp，不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数，这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。尽管如此，在这项新的划时代的测序技术刚出现的时候，科学界对这项新技术却并不热衷。许多习惯用桑格技术的科学家怀疑新技术的准确度、阅读能力、成本消费、实用性。代理Sanger型测序硬件的经销商害怕其投资失败而首先提出了这些怀疑。 然而大多数人却忽略了一个事实，即桑格技术的普及最初也遇到同样的阻碍。桑格技术刚开发出来时，阅读能力很难超过 25bp，即使在Fred Sanger双脱氧终止法发明后也只达到80bp，如今却达到了750bp；而新发展的合成测序技术，应用焦磷酸测序方法，其阅读能力最初只有 100bp，推向市场16个月后增加至250bp，随着技术的不断完善，目前已达到了400bp，很快就接近桑格技术目前的水平。除了阅读能力外，能否以有限的成本用一台仪器产生足够数量的序列标记也是另一个需要改善的重要问题。这个问题已经被Roche公司解决了，应用他们的系统，仅花费阅读35bp或者更小片段的成本就能产生比35bp多10倍的序列标记。

图二：GS FLX 高通量测序方法原理示意图

一、高通量测序的应用

高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差。 依靠后期强大的生物信息学分析能力，对照一个参比基因组(reference genome)高通量测序技术可以非常轻松完成基因组重测序(re-sequence)，2007年van Orsouw等人结合改进的AFLP 技术和454 测序技术对玉米基因组进行了重测序，该重测序实验发现的超过75%的SNP位点能够用SNPWave技术验证，提供了一条对复杂基因组特别是含有高度重复序列的植物基因组进行多态性分析的技术路线。2008年Hillier对线虫CB4858 品系进行Solexa重测序，寻找线虫基因组中的SNP位点和单位点的缺失或扩增。但是也应该看到，由于高通量测序读取长度的限制，使其在对未知基因组进行从头测序(novo sequencing)的应用受到限制，这部分工作仍然需要传统测序(读取长度达到850 碱基)的协助。但是这并不影响高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，microRNA表达谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。