作者：中华医学网发布时间：2017-10-13 10:32浏览：
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a,２N NaOH浸泡１小时以上，自来水冲洗，海绵或软布蘸洗涤剂将板清洗干净，自来水冲洗掉全部洗涤剂，无离子水中过三遍，晾干。b, 在1ml95%乙醇，0.5%冰乙酸中加入5μl粘合硅烷。c, 用b中所配溶液浸透薄棉纸，用此薄棉纸均匀擦拭玻璃板d，晾干后，用95%乙醇单向擦拭该板，然后略微用力沿垂直方向擦拭该板。重复３此这一乙醇擦拭过程。
Ｂ：短板（带凹槽、硅化处理，不粘胶板）
a,海绵或软布蘸洗涤剂将板清洗干净，自来水冲洗掉全部洗涤剂，无离子水中过三遍，晾干。b，用硅化液浸透的薄棉纸均匀擦拭该板。c，晾干后，用薄棉纸擦掉多余的硅化液。
２，按图将两块玻璃板及夹条安装好。
３，制胶 ６％的变性胶
Acr/Bis 19:1 ,
尿素 8M
Tris 90mM
硼酸 90mM
EDTA 2mM
TEMED(%) 0.05
抽气 ４℃保存
临用前按400μl/75ml预混液的比例加入过硫酸氨(100mg/ml)
４：灌胶
（三）：电泳
１，胶凝后，插入鲨鱼齿,
２，将Ⅰ中制备好的样品在90℃加热２分钟
３，加样，电泳，维持2000伏以上恒压（在加样前，同样电压预电泳），直至指示剂跑到胶下沿。
电极缓冲液为1×TBE。
（四）：银染
１，电泳结束后，橇开板，将附着胶的一块板置于固定/终止液中浸泡过夜或震荡3０分钟，直至指示染料消失。
２，凝胶洗涤，用超纯水震荡洗涤胶３次，每次２分钟，凝胶板从水中取出后，竖起控水１０－２０秒。
３，染色，将胶板移至染色液中，摇床震荡３０分钟。
４，凝胶洗涤，将染色后的胶板，放入超纯水中２－３秒后，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的显影液中（用量为总量的1/2），充分震荡，当第一批条带后，把胶板移入预冷的另一半显影液中，震荡，直至全部条带出现。
注意：从放入水到放入显影液中，之间时间不超过５－１０秒。
５，终止显影，在显影液中直接加入等体积的固定/终止溶液（第一步操作时用过的），停止显影反应并固定影象。
６，洗涤凝胶，在超纯水中洗涤凝胶２次，每次２分钟。
７，胶板干燥，将显影后的胶板置于室温下，自然干燥。
８，干燥后的胶片可以永久保存，或进行拍照或进行EDF胶片拷贝。
（五）EDF胶片拷贝
EDF胶片拷贝能增强条带的显色强度
1:在暗室中将干燥后的胶板置于光源上(胶面向上)
2:裁一条EDF胶片,进行曝光时间的确定
3:在红灯下,找到EDF胶片上有缺刻的一角,然后把EDF放于胶上,有缺刻的位置为左上角.在EDF上再放一干净的玻璃板。
4:根据以确定的曝光时间,对EDF曝光。
5:显影 在Kodax GBX显影液中显影1-5分钟
6:水洗1分钟
7:在Kodax GBX中定影3分钟
8:水洗1分钟.
9:烤干。
注意:
1： 鲨鱼齿插入深度不能过深,否则可上样量少,也不能过浅,否则易造成点样槽渗漏,一般插入深度以0.5毫米为好。2：一定要进行预电泳,其作用为提高胶的温度,防止DNA单链间的胶连3：上样前应用1毫升枪吸打上样孔,吸取样品应尽量不把上层矿物油带入,加样动作要快,以防止扩散。4：本实验所有部分尤其是（三），（四）、（五）三部分操作中一定要戴手套。
附录1：未知模板的用量
[200bp(PCR产物) 16ng]
[3000-5000bp（超螺旋质粒DNA4μg]
[48000bp(λ或粘粒DNA 1μg]
2：测序反应中所用聚合酶的特性
酶 持续合成能力bp 聚合速率bp/秒
Klenow片段 15-20 45
AMV 未测 5
测序酶 2000 300
Taq酶 >7600 35-100
3：引物设计要求
1):碱基组成应匀称，G+C含量为40-55%，长度为１８聚。如G+C含量在此值外，则长度应为18+n/2,对于AT丰富区，n=50-(G+C)%；对于GC丰富区，n=(G+C)%-50。2)，引物中不应含二重对称区，以防止形成发夹或颈环结构。3):引物纯度至少要到电泳级
4:各种溶液组成
5:ddNTP与dNTP的组成比例