探针的非放射性标记技术

核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的寡核苷酸链。核酸探针有双链DNA探针、单链DNA 探针、RNA探针和寡核苷酸探针。特异性探针来源于目的核酸的酶切片断、dd-PCR等差异显示中出现的差异片断、AFLP、RFLP、RAPD、SSR、CFLP等标记实验中出现的特异性基因标记片断。可以通过人工合成、酶切、PCR等手段富集探针。探针必须带上标记才能有用，不带标记的探针称为裸探针。探针标记是进行杂交及一些分子标记研究的前提。探针标记有单链标记、双链标记、直接标记及间接标记，放射性标记和非放标记。本实验主要介绍非放标记。目前国内外使用的非放标记主要有光敏生物素标记、地高辛标记及ECL直接化学发光标记等。

1光敏生物素对探针的标记

在强可见光的照射下，光敏生物素中的N3基团光解放出N2,生成反应活性极高的氮烯；N基团，易与核酸碱基中的伯胺基结合而形成共价标记。核酸中每100-150个碱基可结合一个生物素。

一：仪器：光标记灯离心机

二：试剂

光敏素试剂盒

光敏素试剂醋酸盐

亲和素－碱性磷酸酶检测系统

亲和素－碱性磷酸酶

BCIP(实验时10mg溶于200μlDMF中)

NBT(实验时15mg溶于200μl70%DMF中)

二甲基甲酰胺（DMF),仲丁醇, 3ＭNaAC无水乙醇

三：操作

（一）核酸探针的光敏素标记

１：在一支灭菌的Eppendof离心管中加入20μl探针DNA(0.5-1μg/μl，溶解于水中

2：避光条件下加等体积的光敏生物素醋酸盐并混匀。

3：将装有反应液的离心管置于冰模中，暗室中在光标记灯下照射30分钟（灯距样品15cm）。

4：加入无菌水至总体积为100μl

5：加入100μl仲丁醇，混匀。10000rpm离心10min,去上层液，再加入仲丁醇，离心，使水相浓缩至30-40μl。

6：加入4μl的3M NaAC,混匀，再加入２体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃过夜或-70℃15min

7：4℃15000rpm 离心15min,取桔红色沉淀。

8：真空干燥，沉淀溶于无菌水中。

注：1仲丁醇与水能部分互溶，因此最好先用水将其饱和，以防DNA丢失，如不饱和则可起到浓缩水相的作用，

2：买来的或要来的探针一般都保存在TE缓冲液中，因此在使用前脱盐，否则光敏素与Tris反应，使电泳条带拖尾。

3：在沉淀探针时，NaAC能不加，尽量不加。沉淀离心是最好在低温下进行，

2地高辛对探针的标记

带有地高辛标记的dUTP（图14-1）通过缺口翻译、随机翻译或PCR等反应而使探针核酸片段带有地高辛，进一步可与带有AP、CSP等各种抗地高辛抗体复合物发生免疫反应，使探针上带有AP等分钟，进一步能催化化学或发光反应。图14－2为各种DIG标记探针及检测类型汇总；图14－3为DIG标记探针的方法；图14－5为标记探针应用；图14－4为DIG标记探针的检测方法。

图14－1DIG标记dUTP结构图
图14－2：DIG标记图示
图14－3DIG标记探针方法
本实验拟通过随机引物及PCR方法，将DNA探针片段用DIG标记，进一步掌握探针的标记技术。

随机引物法标记DIG探针

1：1ug(10ng <DNA探针量<3ug)待标记DNA溶于16ul水中，在沸水浴10分钟变性，迅速放于冰浴（NaCl或乙醇冰浴）冷却。

2：在冰浴上，上述管中加入4ulDIG－HIGH－Prime混合物（含5×反应缓冲液、50％甘油、各1mM的dATP,dCTP,dGTP,0.65mM的dTTP及0.35mM的DIG－dUTP ，1U/ulKlenow酶）。

3：离心混合，3760分钟或过夜

4：加2ul0.2MEDTA(pH8.0)或65℃10min终止反应。

5：在上述20/22ul反应体系中加入2.5ul4MliCl,75ul(-20℃预冷)乙醇沉淀,70%乙醇洗沉淀，真空干燥，复溶于少量PH8.0TE中，－20℃保存（忌讳反复冻融）。

3：ECL方法对探针的标记

一；仪器：同上

二：试剂：ECL标记盒，其余同上

三：操作：1：将待标记的DNA稀释至10ng/ml

2：将上述DNA在100℃5分钟，冰浴5分钟

3：离心后加入10ulECL标记混合物，混合均匀

4：加10ul戊二醛溶液混匀，37℃20分钟，此反应液可直接用于杂交也可在50％甘油中－20℃保存。

4：PCR扩增制备带标记探针

用标记脱氧单核苷酸部分代替PCR反应体系中的脱氧核苷酸（一般是带标记的dUTP代替dTTP），经PCR扩增后标记基团随机搀入扩增产物－DNA探针中。这样使探针浓度高，可检测标记基团量多，灵敏度高，与缺口平移法制备探针相比，具有方便简捷的特点，并且由于具高灵敏度因此在检测低丰度，低拷贝数的目的片断时，尤其有效。一般可用来进行搀入的带标记基团可以为同位素标记基团、臭化脱氧尿苷标记基团、也可为其他非放标记基团如生物素、地高辛等。下面以生物素和地高辛为例介绍探针的PCR标记技术。

一：生物素标记

应用bio-11-dUTP部分替代dTTP搀入PCR扩增探针中

操作1：配制反应体系

dNTP的组成dATP、dCTP、dGTP各20mmol,dTTP 15mmol, bio-11-dUTP 5mmol混匀，其他试剂如常规PCR。

2：25循环后，冻存，取出化冻，趁下层水相尚在冰冻状态，吸尽石蜡油

3：水相中20mg/ml糖原1ul, pH5.2 2.5MnaAC10ul,220ul无水乙醇。混匀后－20℃过夜

4：离心取沉淀，冷冻干燥后100ul水或TE复溶。

二：地高辛标记

应用dig-11-dUTP部分替代dTTP搀入PCR扩增探针中

操作1：配制反应体系

dNTP的组成dATP、dCTP、dGTP各200umol,dTTP 130umol, bio-11-dUTP 70umol混匀，其他试剂如常规PCR。

2：35循环扩增产物

3：扩增产物纯化与DIG随机标记探针方法相同（仅沉淀时，50ulPCR反应液中加入5ul4MliCl和150ul冰乙醇）。

注：1：标记时标记基团在dNTP中占的比例不能太高，因标记基团与dTTP相比具位阻效应，比例太高PCR扩增及以后的杂交都要受到影响。

2：靶DNA用量不能太高，生物素标记中控制在0.2fmol左右；地高辛标记中可低至0.1ng。