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带型
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原因
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结果分析
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DNA完全没有被内切酶切割
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内切酶失活
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标准底物检测酶活性
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DNA不纯，含 SDS有，酚， EDTA等内切酶抑制因子
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将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
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条件不适（试剂、温度）
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检查反应系统是否最佳
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DNA酶切位点上的碱基被甲基化
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换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株
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DNA酶切位点上没有甲基化（如D I）
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换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替D I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增
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DNA位点上存在其它修饰
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将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证
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DNA不存在该酶识别顺序
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换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证
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DNA切割不完全
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内切酶活性下降
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用5-10倍量过量消化
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内切酶稀释不正确
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用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶
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DNA不纯，反应条件不佳
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用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶
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内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰
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用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶
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部分DNA溶液粘在管壁上
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反应前离心数秒
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内切酶溶液粘度大，取样不准
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将内切酶稀释，增大取样体积
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酶切后DNA粘末端退火
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电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷
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由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性
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使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡
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过度稀释使酶活性降低
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适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏
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反应条件不适
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使用最佳反应体系
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识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序
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加大酶量5-10倍
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DNA片段数目多于理伦值
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内切酶星状活
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检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量
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其它内切酶污染
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用λDNA作底物检查酶切结果
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底物中含其它DNA杂质
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电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段
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酶切后没有观察到DNA片段存在
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DNA定量错误（如RNA含量较高）
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用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量
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在酶切反应液中形成非特异的沉淀
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在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次
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内切酶保存期内快速失活
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保存温度不合适
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内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存
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以稀释形式保存
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稀释酶液不宜长期存放，应一次使用
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贮藏缓冲液不适当
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使用厂家推荐的贮藏缓冲液
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低蛋白浓度
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内切酶与500ug/ml的A一起保存
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电泳DNA片段带型弥散不均
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DNA上结合有蛋白质
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电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的 SDS，酚/氯仿抽提纯化
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内切酶中含有DNA外切酶
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减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶
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酶切后的DNA片段连接效率低
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含磷酸盐的浓度高
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透析，乙醇沉淀去除磷酸盐
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内切酶失活不全或含有ATP酶
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延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA
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平末端连接
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加大T4DNA Ligase用量
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外切酶污染
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减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA
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连接缓冲液不合适
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重新配制连接缓冲液
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