酶免蛋白(及酶)—小分子半抗原结合物的制备

蛋白(及酶)—小分子半抗原结合物的制备
在临床实验室中，我们常常会遇到有关小分子物质如激素、治疗药物和毒品等的测定问题，而这些小分子通常分子量小于1 000，只是半抗原，仅有反应原性，没有免疫原性，如像蛋白大分子一样，将其直接免疫动物，不能得到小分子的抗体，只有将其先与载体蛋白相连接，组成完全抗原免疫动物，才能得到特异的抗小分子抗体，然后才能建立相应的小分子的酶免疫测定方法。此外，由于小分子上抗原决定簇有限及空间位阻的原因，其在与特异抗体的结合时，一个小分子只能与一个抗体分子结合，因此，如使用ELISA方法测定小分子，通常只能应用竞争抑制模式，这就需要制备酶—小分子结合物。因此，要建立小分子物质的免疫测定方法，必须有一个制备蛋白—小分子半抗原结合物的过程。
一、小分子的特性及蛋白载体的选择

(一)小分子上与蛋白连接基团的选择对所产生抗体的特异性的影响小分子为具有多种反应基团如氨基、羧基、醛基等的物质，这些基团既是其区别于与其相近似分子的特异性抗原决定簇之所在，也是其用于与蛋白分子的交联的结合基团。因此，当这些基团与蛋白大分子结合后，再免疫动物所得到的抗体，往往特异性会有所降低，尤其是分子结构上相近似的小分子，如选用每种小分子物质特有基团连接蛋白，则免疫动物后所得抗体的特异性就差，因为其特异的抗原决定簇在刺激动物机体抗体的生成中不起作用，而共同的基团所组成的抗原决定簇却不受影响，激发机体的免疫应答而产生能结合具有此决定簇的所有近似小分子的抗体。因此，选择相关小分子均有基团用于与蛋白分子的交联，得到的抗体具有较好的特异性。此外，在小分子与载体蛋白之间加入一连接空间臂，也能改善所得抗体的特异性。

(二)小分子与载体蛋白的分子比对抗体产生的影响

对于免疫动物产生抗体来说，并不是载体蛋白上小分子越多越好，而是一定数量的小分子对免疫动物产生抗体来说是最理想的，如使用牛血清白蛋白(A)作为载体蛋白，每分子结合8～25个小分子较为合适。
(三)载体蛋白的选择

选择适当的载体蛋白对于有效地免疫动物得到抗小分子抗体非常关键。最常用的载体蛋白是与拟使用免疫动物不同种属的动物血清白蛋白、戚钥血蓝蛋白(keyholelimpet hemocya—nin)、卵清蛋白及纤维蛋白原等。载体蛋白一般以其最具反应活性的基团如s—和。—氨基(pKa分别为10和8)、酚基、巯基(pKa为9)、咪唑(pKa为7)和羧基(pKa2～4)等，所谓的pKa为基团的一半处于质子化时的pH值。因此，pH值的变化会引起这些基团反应活性的改变，亲核基团的非质子化形式具有反应性。

二、用于小分子与蛋白交联试剂的选择

用于小分子与蛋白交联的试剂可分为四大类，即①乙酰化试剂；②烷基化试剂；③氧化还原试剂；④亲电子试剂。乙酰化试剂的通用公式为R-C(＝O)—X，源于羧基(—COOH)的活化，如醋酸酐或混合酸酐、N—羟琥珀酰亚胺酯(NHS)和S—乙酰琉基琥珀酸酐等。由于所涉及基团的pKa，在碱性条件下，乙酰化试剂主要与蛋白的氨基(去质子的赖氨酸)和酪氨酸残基形成稳定，的衍生物，与半胱氨酸或组氨酸残基形成不稳定的衍生物。修饰的酪氨酸残基可用羟胺处理而再生。一般情况下，酸酐会迅速水解，因此，其乙酰化作用与试剂的水解之间处于竞争之中。烷基化试剂中重要的是马来酰胺，交联反应在较为温和的碱性条件下(pH 7．0～8．5)进行。烷基化试剂的质子型是N—乙酰马来酰胺和芳香基卤化物，如DNFB或TDIC。氧化还原试剂如二硫化物很少用于交联反应。亲电子试剂中最常用的是重氮盐。

交联试剂也可按其在小分子与载体蛋白之间形成桥接的本质分类：①活化羧基(大多在小分子上)使其能与氨基反应的试剂，这是使用最为广泛的交联试剂；②能在两个氨基之间形成桥接的试剂；③与酪氨酸或组氨酸残基连接产生偶氮基的试剂。

与蛋白之间交联一样，用于小分子和蛋白间交联的试剂的浓度亦应较高，从而增加交联物形成的可能性。可溶性相对差的试剂可置于5％～25％有机溶剂中。但不管使用何种交联方法，都要尽可能避免载体蛋白本身的交联，例如使用两步交联方法。如果小分子的羧基或氨基不是其特异性所必需的，则其可直接用于与蛋白的交联，否则就需要在小分子上衍生此类基团。