作者：中华医学网发布时间：2017-10-13 08:10浏览：
次
在免疫组化过程中，为了更好的说明问题和查找原因，最好设置阳性对照片（已知的高表达相应抗原的组织）和阴性对照组织片（不加一抗但是加二抗系统/不加任何 抗体两组），所有操作过程应完全一致。
染色弱或者没有染色（按照先后顺序，先排除一些简单的原因）:
|
可能原因 |
解决办法 |
| 试剂使用顺序错误或者漏加试剂 | 重复实验，保证每一步均正确 |
| 二抗和一抗不匹配 | 选择匹配的二抗 |
| 底物和酶不匹配 | 选用匹配的底物 |
| 酶失活 | 换用新的酶（将酶和底物混合，看是否显色？） |
| 组织中没有待测抗原表达或者表达水平低 | 使用阳性对照片 |
| 抗体浓度太低 | 增加抗体浓度.最好使用不同浓度的抗体，决定最佳浓度 |
| 抗体孵育时间不充分 | 延长抗体孵育时间 |
| 底物孵育不充分 | 延长底物孵育时间 |
| 抗体储存不当，导致失效 | 将抗体分装，低温保存 (-20 to -70 C) ，避免反复冻溶。稀释抗体在4保存1-2周，避免时间过长。或者根据说明书进行恰当的保存 |
| 一抗失效 | 换用新的一抗 |
| 二抗失效 | 换用新的抗体（能否成功与其它一抗配合？） |
| 脱石腊不充分 | 延长脱腊时间或者换用新的二甲苯 |
| 组织固定不充分或者不当 | 增加固定时间或者改用不同的固定方法 |
| 组织固定过度 | 减少固定时间。若已固定过度，则需使用正确的或者推荐的抗原修复方法 |
| 复染试剂与底物系统不匹配 | 选择正确的复染试剂（不加复染剂，看是否有 组织染色？） |
| 封片剂不正确 | 选择正确的封片剂 |
染色背景高:
|
可能原因 |
解决办法 |
| 洗片不充分 | 每步之间至少洗片3次 |
| 组织含有内源性的酶，如HRP/AP | 在加入一抗之前使用3％的H2O2甲醇封闭内源性HRP活性，使用左旋咪唑(levamisole)溶液阻断内源性AP活性。或者换用葡萄糖 氧化酶系统 |
| 组织含有内源性生物素（尤其是肾脏、肝和脾） | 在加入一抗之前， 血清封闭之后使用avidin/biotin阻断试剂。或者避免使用biotin-avidin系统或改用IF方法(直接将酶和底物加到组织片上，看是否显色？) |
| 一抗的非特异性结合或者抗体浓度过高 | 增加一抗的稀释度 |
| 二抗和组织非特异性结合 | 使用与二抗来源相同的正常动物 血清（一般是10％）封闭，必要时可以将血清浓度加大 |
| 组织固定不充分，抗原扩散 | Increase duration of postfixation |
| 使用小鼠来源的二抗检测小鼠组织 | 在加一抗之前使用MouseOnMouse封闭试剂 |
| 干片 | 染色过程中避免出现干片现象 |
染色强度过大:
|
可能原因 |
解决办法 |
| 一抗或者二抗浓度过高 | 降低抗体浓度。或者使用不同的浓度，决定最佳染色浓度 |
| 孵育时间过长 | 减少孵育时间 |
| 孵育温度太高 | 降低孵育温度，在4℃过夜或者 37℃0.5-1小时或者RT |
| 底物孵育时间过长 | 减少孵育时间 |
| 干片 | 染色过程中避免出现干片现象 |