单克隆抗体的制备方法 1

动物的选择与免疫
 
　　1．动物的选择 　纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
 
　　2．免疫方案 　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
 
　　（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
 
　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）
 
　　↓3周后
 
　　第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）
 
　　↓3周后
 
　　第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）
 
　　↓2～3周
 
　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）
 
　　↓3天后
 
　　取脾融合
 
　　目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
 
　　（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
 
　　初次免疫 1×107/0.5ml ip
 
　　↓2～3周后
 
　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip
 
　　↓3周后
 
　　加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv
 
　　↓
 
　　取脾融合
细胞融合

 

　　1．细胞融合前准备

　　（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。

表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系

名 称	来 源	耐 受 药 物	Ig链
			H L
P3/X63-Ag8(X63)	BALB/C骨髓瘤MOPC-21	8-氮鸟嘌呤	r1 　K
P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)	P3/X63-Ag8	8-氮鸟嘌呤	－ －
P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)	P3/X63-Ag8	8-氮鸟嘌呤	－ K（不分泌型）
P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)	（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤	8-氮鸟嘌呤	－ －
SP2/0-Ag14(SP2/0)	（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤	8-氮鸟嘌呤	－ －
F0	BALB/C骨髓瘤	8-氮鸟嘌呤	－ －
S194/5.XXO.BU.1	P3/X63-Ag8	5-溴脱氧尿嘧啶核苷	－ －
MPC11-45.6TG1.7	BALB/C骨髓瘤MPC-11	6-巯鸟嘌呤	r2b 　K
210.RCY3.Ag1.2.3	LOU大鼠骨髓瘤R210	8-氮鸟嘌呤	－　 K
GM15006TG-A12	人骨髓瘤GM1500	6-巯鸟嘌呤	r1 　K
U-266AR	人骨髓瘤U-266	8-氮鸟嘌呤	ε　　λ

　　骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液 ，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。
 
　　（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节　需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。
 
　　2．细胞融合的步骤
 
　　（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。
 
　　与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周
 
↓
 
　　拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min
 
　　↓
 
　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
 
　　↓
 
　　用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）
 
　　↓
 
　　反复冲洗，吸出冲洗液
 
　　↓
 
　　冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min
 
　　↓
 
　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml
 
　　↓
 
　　加入96孔板，100μl/孔
 
　　↓
 
　　放入37。c CO2孵箱培养
 
　　（2）制备免疫脾细胞
 
　　最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死
 
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　　无菌取脾脏，培养液洗 一次
 
　　↓
 
　　脾脏研碎，过不锈钢筛网
 
　　↓
 
　　离心，细胞用培养液洗2次
 
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　　计数
 
　　↓
 
　　取108脾淋巴细胞悬液备用
 
　　（3）制备骨髓瘤细胞
 
　　取对数生长骨髓瘤细胞离心
 
　　↓
 
　　用无血清培养液洗2次
 
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　　计数，取得×107细胞备用