（3）间接血凝试验
间接血凝试验又称被动血凝试验（PHA），是目前应用较广的检测方法之一。本试验是以包被可溶性抗原的红细胞作为指示系统，当被检抗体与包被在红细胞上的抗原产生特异性反应时，导致红细胞呈凝集现象。可见，该法具有灵敏、快速、容易操作和无需昂贵仪器等优点，而且经改用醛化红细胞以后，克服原来重复性差的缺点。
①器材和试剂
a、绵羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。
b、缓冲液：PBS（PH7.2）；醋酸缓冲液。
c、甲醛，丙酮醛，NaN3，抗凝剂等。
d、血凝板，振荡器等。
②多糖抗原的间接血凝试验
a、甲醛化绵羊红细胞的制备：无菌采集绵羊颈静脉血50ml，用枸橼酸钠作抗凝剂；用5倍于红细胞压积的PH7.2 PBS（Na2HPO4•12H2O 3.58g，KH2PO4 0.41g，NaCl 8.01g，蒸馏水1000ml）充分洗涤5次，每次1500r/min 5-10分钟，直至上清测定无蛋白质（用饱和硫酸铵滴定上清，观察有无白色沉淀），再以相同缓冲液配成25%红细胞悬液；将25%红细胞悬液与20%甲醛以2.5：1的比例混匀，37℃水浴作用2小时，每15分钟振荡一次，红细胞颜色逐渐由鲜红色转变为棕色；以PH7.2 PBS洗涤4次，每次2000r/min 10分钟，再以同样的PBS制成25%红细胞悬液；其后，重复醛化一次，方法同前；最后配成20%醛化绵羊红细胞悬液，加甲醛至0.3%防腐，4℃保存备用。
b、脂多糖抗原致敏甲醛化绵羊红细胞的制备：取脂多糖（LPS），以0.2mol/L PH8.0 PB液，调整多糖浓度至120ug/ml，然后100℃水浴处理1小时；将冷却至37℃的热处理LPS与6%醛化红细胞等量混合，37℃搅拌作用45分钟；取出离心2000r/min 10分钟，以0.01mol/L PH7.2 PBS洗涤4次；配制成4%致敏血球，分装，保存于4℃备用，或冻干保存。
c、McAb的筛选：取待测McAb样品25ul，加入V型微量血凝板孔中，同时设立阴性、阳性对照；再加入0.5-4%致敏红血球悬液25ul，在振荡器上混匀30秒；置室温或37℃ 30-60分钟观察结果。阴性对照孔应呈紧缩的圆点。
③可溶性蛋白抗原的间接血凝试验
a、红细胞醛化：采用双醛法。采绵羊或人“O”型抗凝血，每次加10倍于红细胞压积的PBS洗涤4-6次，然后配成8%红细胞悬液；向此8%红细胞悬液缓慢加入等量含有3%丙酮醛和3%甲醛的PBS，于室温缓慢搅拌17小时；其后洗涤3次，配成20%双醛化红细胞悬液，加0.1% NaN3防腐，4℃保存备用。
b、致敏红细胞：取20%双醛化红细胞0.1ml，1500r/min 10分钟，弃上清，沉积红细胞加0.2mol/L PH4.0 醋酸-醋酸钠缓冲液1ml，并加最适浓度（应预先测定，蛋白抗原为50ug/ml左右）的抗原1ml，混匀，于45℃致敏30分钟，有时轻轻摇动，使红细胞不下沉。然后离心去上清，并用20倍于红细胞压积的PBS洗3-4次，最后用PBS配成0.5-1%致敏红细胞，4℃保存备用。
c、McAb测定：同上法。
（4）放射免疫测定
放射免疫测定是用放射性同位素标记抗原或抗体，以检测相应抗原或抗体的定量方法。在筛选和鉴定单抗时常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以检测样品中的McAb，其操作步骤如下：
a、用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至适宜的浓度（1-100ug/ml），滴加聚乙烯微板孔内，100ul/孔，4℃过夜或37℃ 2小时。
b、弃去抗原液，每孔加100ul含0.5-1% BSA的PBS，4℃ 1-2小时封闭。
c、用BSA-PBS洗涤3次，每次3分钟。
d、加待检样品，每孔100ul，设立阴性孔、阳性孔和空白孔；37℃1-2小时，同法洗涤。
e、每孔加125I标记的抗鼠Ig抗体工作液100ul，37℃ 1-2小时，同法洗涤。
f、用γ-射线闪烁计数仪分别测定各孔放射性。通常要求样品孔和阳性对照孔的放射性脉冲分别超过本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性为基准，凡样品孔与阴性孔放射性之比大于3的样品定为阳性。
[page]4、杂交瘤细胞的克隆化
从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或多个杂交瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。另一方面，杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已不再分泌抗体的细胞，得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系（又称亚克隆），也需要克隆化。另外，长期液氮冻存的杂交瘤细胞，复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失，因此也应作克隆化，以检测抗体分泌情况。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化，有时还需进行多次。所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。克隆化的方法很多，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。这里介绍最简单也是使用最广泛的前两种方法。
（1） 有限稀释法
材料：
a、96孔细胞培养板等；
b、HT培养基；
c、活力强的杂交瘤细胞；
d、小鼠腹腔细胞。
方法：
a、制备小鼠腹腔细胞。同“细胞融合”一节中的方法。
b、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3中不同的稀释度。
c、按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。
d、每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。
e、37℃、7.5% CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。
f、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。
g、本法中（b）、（c）、（d）也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。
（2）软琼脂法
材料：
a、HT培养基（双倍浓度）。
b、用0.15mol/L NaCl配制的2.0%琼脂糖：称取2.0g细胞培养用琼脂糖，悬浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121℃高压灭菌15分钟，分装10ml小瓶，冷却后4℃保存。
c、小鼠腹腔细胞。
d、灭菌平皿。
e、45℃水浴。
f、活力很好的杂交瘤细胞。
方法：
a、在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）单层。
b、临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1%琼脂糖培养液，45℃水浴中温育。
c、吸去平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml，室温10分钟。
d、取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1%琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层。
e、37℃、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。
f、吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。
5、杂交瘤细胞的冻存与复苏
（1）杂交瘤细胞的冻存
在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以免遭到不测。在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。
细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃?? -20℃，每分钟下降1℃；-20℃?? -40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。下面介绍我们实验室的细胞冻存方法，经几年来对多种细胞的使用，细胞复苏存活率均在 80%以上。
①材料：
a、带盖吸管筒一只（铝质或洋铁皮制），内壁（包括筒底和盖）衬1-2层石棉纸或石棉布。
b、含10-20%血清、5-10% DMSO的HT培养基，冰浴降温至0℃左右（用作冻存液）。
c、灭菌安瓶或带盖小瓶。
d、-70℃冰箱。
e、液氮及液氮罐。
f、处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。
②方法：
a、将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右/ml，分装安瓶，每瓶1ml，置冰浴上；安瓶上标明细胞名称、冻存日期、批号等。
b、安瓶封口后仍置冰浴上。
c、将安瓶放入一带收口绳的小布袋内，布袋上标明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸管筒内，置-70℃冰箱。
d、2-4小时后或过夜后从-70℃冰箱取出吸管筒，将盛有细胞的布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。
e、液氮罐应定期补充液氮（最好是专人管理）；补充液氮及存取细胞时应带保护眼镜和手套，以免因液氮冻伤等