③全菌抗原的ELISAS
a、新鲜培养的细菌用蒸馏水或PBS悬浮，并调整细菌浓度至1×108个/ml。必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作，最好是灭活处理。
b、每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml+25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小时，蒸馏水洗涤3次；加上述细菌悬液50ul/孔；37-56℃烘干；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。
c、步骤b也可采用先每孔加50ul细菌悬液，37℃-56℃烘干，然后用-20℃预冷的无水甲醇室温作用15分钟，蒸馏水洗涤3次；每孔加 200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。
d、洗涤液洗3次；此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。
e、以下步骤同上法。
④用全细胞抗原的ELISA
a、按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度悬液。
b、淋巴细胞悬液的制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1500rpm离心30分钟，吸取界面细胞洗涤二次，即为新鲜淋巴细胞悬液。该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加0.83%的氯化铵溶液，室温10分钟，洗涤一次即可。将该细胞悬液稀释至适当浓度。
c、每孔加100ul上述a或b的细胞悬液，使每孔含细胞5×104个；1500r/min 15分钟，甩去上清；室温干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分钟；可4℃或-20℃保存备用。
d、以下步骤同上法。
⑤抗体捕捉ELISA试验
本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗体捕捉待检样品中的McAb，再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。该法是常用的ELISA中较理想的一种；其操作步骤如下：
a、以适当浓度的纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板，每孔加100ul，37℃ 2小时或4℃过夜。
b、洗涤、拍干后加待测的McAb样品，37℃ 1-2小时。
c、洗涤后加适量的抗原，37℃ 1-2小时。
d、洗涤后加入酶标多克隆抗体，37℃ 1-2小时。洗涤后加底物显色，判定结果。
⑥ABC-ELISA试验
ABC-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，增加了生物素（Biotin）与亲和素（Avidin）间的放大作用。亲和素有4个亚单位组成，对生物素有高度的亲合力。生物素很易与蛋白质共价结合。因此，结合了酶的亲和素与结合有抗体的生物素发生反应即起到了多极放大作用。其操作步骤如下：
a、已知抗原的包被及加待检McAb样品，同间接ELISA试验。
b、加生物素化抗鼠Ig抗体，每孔100ul，37℃ 1小时；洗涤。
c、加酶标亲和素，每孔100ul，37℃ 30分钟洗涤；加底物显色，判定结果。
⑦Dot-ELISA试验
免疫斑点试验（Dot-ELISA）是以硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜为固相载体，进行抗原抗体反应的免疫检测手段。该法采用不溶性底物（如DAB，或4-氯萘酚或AgNO3等），其与相应标记物（HRP、AP、胶体金）作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色，从而易于判定结果。根据所用的标记物不同，可分为HRP 免疫斑点试验、AP免疫斑点试验和免疫金银斑点法等。其操作步骤大致如下：
a、将抗原液2-5ul点加于纤维素膜上，室温37℃干燥。
b、将纤维膜浸入封闭液中，37℃ 30分钟。
c、用洗涤液洗2次，吸干后加待检McAb样品，37℃ 1小时；用洗涤液振荡洗涤三次，每次5分钟，加HRP或AP或胶体金标记的抗鼠Ig抗体，37℃作用30分钟。
d、同法洗涤，吸干，用新配的相应底物溶液显色，然后水洗终止反应，观察结果。
⑧免疫组化染色法
该法主要用于检测针对细胞抗原成分的McAb，常用的方法是间接免疫过氧化物酶试验（IIP，indirect immunoperoxidase）及APAAP技术。其结果用光镜或倒置显微镜检查。
（2）免疫荧光技术
免疫荧光技术可用于多种抗原的杂交瘤抗体检测，如细胞性抗原（包括细菌和动物细胞）、感染细胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作简单、敏感性高，可直接观察抗原定位等优点，在McAb的筛选与鉴定上具有重要的应用价值。
①器材和试剂
a、供检测抗体用的抗原制备?固定细胞片或板，活细胞悬液。
b、PBS（PH7.2，0.01mol/L）
c、待检的McAb样品。
d、冷丙酮
e、FITC（异硫氰酸荧光素）或TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明荧光素）标记的抗鼠Ig抗体等
f、荧光显微镜，磁力搅拌器，离心机，水浴箱等。
②间接免疫荧光法
a、固定细胞片的制备：生长在盖片上的细胞（接种或未接种病毒），可直接收获盖片，在PBS中洗涤，用4℃丙酮固定10分钟，空气干燥，置密封容器于-20℃保存备用；单细胞悬液可在盖片上制成涂片，固定方法同上。
细胞涂片的制备：将10ul细菌悬液（1×108个/ml）涂抹7×21mm盖片上，自然干燥后，用-20℃丙酮固定10-15分钟，于-20℃保存备用。
b、盖片在去离子水中湿润后置架上滴加10-20ul杂交瘤上清或其他待检样品；设立阳性、阴性对照；置37℃水浴孵育0.5-1小时。
c、取出盖片置PBS中用磁力搅拌器洗涤15分钟。
d、盖片置架上，滴加工作浓度的抗鼠Ig的荧光抗体10-20ul，37℃孵育0.5-1小时。
e、同法洗涤15分钟；取出盖片，用延缓荧光碎灭的封载剂（如缓冲甘油，9份甘油加1份PBS）封于干净载玻片上。
f、光显微镜上观察，阳性结果可见特异性荧光（FITC为黄绿色荧光，TRITC为桔红色荧光）。
g、细胞固定片的制备，也可改在培养板孔中进行，其余步骤同上，在观察结果时，将培养板翻转置于荧光显微镜下，判断标准不变。
③细胞的膜荧光染色
完整的活细胞的细胞膜，抗体不能透过。如果细胞在4℃操作，则荧光染色仅限于细胞膜。必须注意死细胞常以非特异性方式吸附大量荧光抗体，因此试验过程中要保证细胞的高活力。活细胞的膜荧光染色大致步骤如下：
a、制备活性较好的细胞悬液，调节浓度至107个/ml。
b、在小试管（5×50mm）中加入100ul细胞悬液，再加入100ul待检McAb的样品，混匀，4℃作用30-90分钟。
c、用洗涤液（PBS 900ml，小牛血清50ml，4%NaN3 50ml）洗二次，每次加洗涤液1-5ml，1000r/min离心5分钟，弃上清。加入100ul荧光抗体，4℃作用30-90分钟。
d、同法洗涤，将细胞重新悬于20-30ul含10%甘油和10-100ug苯二胺/ml的溶液中；滴加于载玻片上，加盖片封载。
e、立即在荧光显微镜上检查。
f、细胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理盐水固定，立即检查，或至少在4℃可保存一周