免疫血清的制备及效价测定

制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。
 
制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，只要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。
 
测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定，本次实验将采用溶血实验测定所获得的免疫血清的效价。
 
一、免疫血清（浆）的制备

我们要制备的是抗绵羊红细胞 (SRBC) 的免疫血清，即溶血素。
 
实验材料

1. 20% SRBC
 
2. 小白鼠
 
3. 无菌 1ml 注射器
 
4. 抗凝剂 （枸橼酸钠或肝素）
 
5. 小试管
 
实验步骤

1. 免疫动物：初次免疫小鼠为腹腔注射20%SRBC0.2ml,4天后以相同剂量、相同途径加强免疫一次。
 
2. 获得免疫血清（浆）：小鼠初次免疫7天后,摘眼球取血,收入加有抗凝剂的小试管中,2000转/分离心1分钟,上清即为免疫血浆。
 
二、免疫血清（浆）的效价测定—溶血法

实验原理

该方法的基本原理是根据补体的经典激活途径，即当抗原抗体复合物存在时，补体系统被激活，最后形成的攻复合体可使细胞性抗原溶解。当实验中抗原和补体的量固定不变，且对于抗体相对过量时，则随着抗体量的不同，被溶解的细胞性抗原的量也不同，两者成正比关系，因此根据溶解的抗原的多少就可以判断出抗体的量。

实验材料

1. 待测免疫血清（浆）

2. 20%SRBC

3. 补体

4. 生理盐水

5. 试管

实验方法

1. 将前面获得的小鼠抗 SRBC 免疫血浆首先稀释 10 倍，成为 1:10 免疫血浆。

2. 取3个试管,分别编号为A、B、C,用于对1:10免疫血浆的3倍、4倍和5倍稀释，即A号管内为1:30的免疫血浆;B号管为1:40 的免疫血浆；C号管为1:50的免疫血浆。

3. 取 15 支试管，分为A、B、C三列，每列5只，先给每管中加入生理盐水0.5ml,再从A、B、C号管中分别吸取0.5ml血浆加入相应各列的第一个管中,然后各列再进行倍比稀释,血清稀释度如下表：

 

管号	1	2	3	4	5
A 列	1:60	1:120	1:240	1:480	1:960
B 列	1:80	1:160	1:320	1:640	1:1280
C 列	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600

 

 

注意每列的最后一管应该弃去0.5ml液体。

 4. 向每个试管中分别加入SRBC0.25ml和补体0.25ml 。
 
5. 混均各管中的液体,置37°C水浴30~40分钟。
 
结果判定

以发生完全溶血的最高血清稀释度管为效价判定管，其血清稀释度即为免疫血清的效价。
 
注意事项

1. 动物免疫时注意确保SRBC被注射到了腹腔中,要避免注入其他脏器（如肠、膀胱）内。
 
2. 稀释血清时尽量做到精确，注意用于不同列的吸管不要混用。