沉淀反应实验原理、材料和实验方法（1）

可溶性抗原（如血清中的蛋白,组织浸出液,细胞裂解液等）与其相应的抗体在溶液中或凝胶中结合,若比例合适,可形成肉眼可见的抗原-抗体复合物,这就是免疫沉淀反应。免疫沉淀反应可以在小玻璃管中或毛细玻璃管及凝胶平板中进行。在用凝胶平板做实验时,常用琼脂糖凝胶做介质,有的加电流,使反应更快更灵敏。

一、环状沉淀

【 实验原理 】

在环状沉淀试管中，当可溶性抗原与相应特异性抗体结合后，于两者交界面处可形成白色沉淀环。此法系 Ascoli于1902年建立，用于检查兽类内脏、皮毛浸液等标本中炭疽杆菌抗原，由于其较高的灵敏性和特异性，目前仍用于法医学血迹鉴定、流行病学媒介昆虫的吸血习性鉴定等。

【 实验材料 】

待测血迹干燥纸片

抗人血清抗体、抗羊血清抗体和抗鸡血清抗体

生理盐水

环状沉淀管及管架、吸管等。

【 实验方法 】

1、取环状沉淀管3支，分别加入抗人、抗羊和抗鸡血清抗体各0.1ml 于管底部，并注明，置于管架上。

2、另取3支试管，分别将3种血迹纸片加入，再各加生理盐水1ml，室温5-10分钟后将溶液摇匀。

3、吸取上清液分别加入上述含有抗人、抗羊、抗鸡血清抗体的环状沉淀管内，并使两者形成一清晰交界面。置室温下1-5分钟观察结果。

【 结果分析 】

根据是否与已知抗血清出现白色沉淀环，判定血迹类型。

【 注意事项 】

1、因血清分子密度及比重均大于生理盐水，故当加入含有抗原的生理盐水时只需将沉淀管倾斜，加抗原的吸管勿接触抗血清，使含抗原的生理盐水沿管壁缓缓流下，再将沉淀管直立即可呈一清晰交界面。

2、在加抗原时，吸管的头部切勿触及抗血清，否则不仅使抗原抗体混合，不能呈清晰交界面，而且如再用此吸管加抗原于另一支含不同抗血清的沉淀管后，必然会出现交叉反应，无法判定结果。

二 单向扩散

【 实验原理 】

抗原或抗体这两种成分中只有一种扩散，将已知抗体与琼脂混合，将抗原

置于凝胶孔中，抗原则呈辐射状扩散，在孔的周围与抗体结合，在比例合适的地方形成肉眼可见的沉淀环。当抗体的浓度一定时，抗原的浓度与形成沉淀环的直径成正比。

【 实验材料 】

1% 琼脂糖（琼脂糖1g,0.1mol/L pH 8.6 巴比妥-巴比妥钠缓冲液100ml），玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径3mm），水浴箱， 10ml 吸管， 5μl微量加样器，已知抗体，标准抗原，待测抗原。
【 实验方法 】

1 ） 取一张玻璃片，用水冲洗干净，再用少量 75% 乙醇冲洗，晾干后置于水

平台备用。

2 ）将 1% 琼脂糖融化， 56 ℃水浴中保温

3 ） 取 15ml 琼脂糖加到 56 ℃预热的玻璃管中，加入适量的抗体（约 200ml ）充分混匀后平铺于玻璃片上。

4 ） 待凝胶凝固后打孔（直径3mm）

5 ） 将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔中，每孔 5 μ l

6 ） 将凝胶板置于湿盒，室温过夜（24h 以上）后观察结果。、

7 ）绘制标准曲线，测出样品中相应抗原含量。

[ 结果分析 ]

1 本实验主要用于检查血型中 IgG ， IgA ， IgM 以及补体成分 C3 ， C4 等的含量 / 由于各类免疫球蛋白的分子量大小不等，因此同样浓度的 IgG ， IgA ， IgM 在琼脂糖中的扩散速度各异， IgG 扩散最快，形成的沉淀环直径最大， IgM 的分子量最大，扩散速度慢，形成的沉淀环较小。

2 形成的沉淀环大小与抗原或抗体的浓度相关，因此临床检测时应先调整抗体和抗原各自的最适浓度，抗体的最适浓度应使免疫扩散后的沉淀环边缘清晰，且能测出血清中的免疫球蛋白的正常值和最大限度的异常值。抗体浓度过高，形成的沉淀环直径小；浓度过低，不易检测抗原的最高限浓度。沉淀环的大小与所检测的抗原浓度成正比。抗原浓度过低时，沉淀环太小不易测定，过高时，沉淀环太大，浪费抗体。