体外抗体形成细胞检查法（溶血空斑实验 PFC）(Plaque forming ce

PFC测定技术又称溶血空斑试验。是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。自从1963年 Jerne和Nordin首先建立PFC测定技术以来,使免疫学方法得到很大的发展。特别是间接溶血空斑测定法的建立，更扩大了本实验的应用范围。它不仅可以测定产生 IgM 类的抗体产生细胞，而且还可以检测产生其他各类免疫蛋白及其亚类的抗体形成细胞。它不仅可以作为免疫基本理论研究的有力工具，而且还可以作为临床筛检抗肿瘤新药以及研究中药对机体免疫功能的影响（免疫增强剂和免疫抑制剂）的特异指标。

溶血空斑试验分直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验。前者是为测定产生 IgM 型抗体的细胞。因为活化补体的能力强，可以不必另加抗 Ig 试剂（显斑剂），也就是只加细胞和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑测定。至于产生其他类型抗体的（如 IgG 或 IgA 等）细胞检测，就需要在试验系统中另加显斑剂（因为这些类别的抗体活化补体的能力弱）也就是加靶细胞和抗各类 Ig 高纯度的抗血清（系指用高浓度的抗原制备的抗血清）再加补体才能出现可见的空斑，故称间接溶血空斑测定。

小鼠脾PFC测定方法，经多次改进使本法的敏感度不断提高。目前所用的方法分为：琼脂固相法和小室液相法。

其基本原理是将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。

一 琼脂固相法

[实验材料]

（1）玻璃器皿（7X1.5 厘米）

（2）1毫升注射器和青霉素小瓶

（3）水浴(47-49℃ )

（4）Hanks'液

（5）胎牛血清 (56℃30分钟灭活,并经羊红细胞吸收)

（6）琼脂或琼脂糖(表层基0.7%;底层基1.4%;用Hanks'液配制 )

（7）右旋糖酐(DEAE-dxtran分子量50万,用蒸馏水配置10毫克/毫升).

（8）抗-Ig血清(测定间接空斑用)

（9）20%绵羊红细胞悬液(Hanks'液配制)

（10）补体:新鲜豚鼠血清(用前经绵羊红细胞吸收)

[试验方法]

（1）将溶化的底层琼脂倾注平皿形成一薄层, 将其凝固,备用。

（2）将每管含2毫升表层基的试管加热溶化后,放47-49℃水浴内保温。

（3）免疫小鼠脾细胞悬液的制备：将免疫小鼠（腹腔或静脉注射绵羊红细胞 4x10 8 个。测定直接溶血空斑，用免疫后 4 天的鼠。测间接空斑，用免疫后 10 天的小鼠。）拉脱颈椎致死。取出脾脏，用 200 目钢网研磨过滤，细胞计数并检查活细胞的百分率。

（4）实验平皿的制备：将底层平皿和所有试剂预温 40 ℃ 左右。于水浴内保温的表层基中加入以下试剂：

胎牛血清0.1毫升

DEAE-右旋糖酐0.1毫升

适当稀释的抗-Ig血清0.1毫升

20%羊红细胞0.1毫升

脾细胞悬液0.1毫升
充分混匀,倾注于铺有底层之平皿内,在水平台上令表层基铺平,凝固后,37℃1小时,然后每个平皿加1:10稀释的补体1.5-2.0毫升,使均匀覆盖其表面,再次温育30分钟,即可进行空斑计数。

[注意事项]

（1）补体浓度以1:10为宜。

（2）所有器皿和各种试剂在加入表层基前均需预温。

二 小室液相法

[实验材料]

（1）玻璃小室的制备：取两张玻片，其中一张玻片两端及中间各铺一条双面胶带，将另一张重叠于其上压紧，即成窄缝状的Canninham小室c

（2）10% 羊红细胞悬液。

（3）1:2 稀释的补体。

（4）1:2 胎牛血清(56C30分钟灭活,并经羊红细胞吸收) 。

（5）填充液（0.6%SRBC 用 Hanks' 液配制）。

（6）石蜡-凡士林混合物。

（7）抗-Ig血清（测间接空斑）。

[实验方法]

（1）制备脾细胞悬液（同前）,稀释成5X106 细胞/毫升。

（2）填充小室：于含1毫升Hanks'液的试管内加入以下试剂。

1:2胎牛血清0.2毫升。

10%羊红细胞悬液0.1毫升。

脾细胞悬液0.1毫升。

1:22 稀释的补体0.1毫升。

抗-Ig血清0.1毫升（间接空斑）。

充分混匀,用毛细管吸取混合液填充小室,空隙以填充液补充。

（3）融化的石蜡-凡士林混合物将小室封闭。 37℃1小时，即可进行空斑计数。

[注意事项]

（1）小室内不能留有气泡。

（2）小室边缘必须用石蜡封严。

（3）严格在限定时间内计数空斑，不得超过数小时