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巨噬细胞、上皮细胞、球体细胞、羊水细胞、血管内皮细胞与原代软

作者:中华医学网发布时间:2017-10-12 13:45浏览:

B(常规培养法)

(1)—(2)相同于盖玻片培养法;(3)接种:将混匀的羊水细胞种置于50ml或100ml细胞培养瓶内,平均10ml羊水细胞收集的细胞种置一瓶加5-10ml混合培养液。(4)培养:酒精灯火先封口,静置培养48小时后观察细胞贴臂及生长情况,5-10天后可见瓶底面有大量羊水细胞生长;(5)终止培养:同A法;(6)细胞收集:将培养液倒入一干净离心管中,加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶,轻轻摇动,使培养瓶底面完全接触消化酶,然后用弯头吸管吹打,待细胞全部脱落后加前培养液终止胰蛋白酶消化。用吸管移细胞悬液于离心管中。1000-2000rpm10分钟,弃上清,留细胞沉虑。若一次消化不彻底,可反复消化;(7)低渗及预固定:加预温37℃KCL溶液10ml,37℃温育30分钟,加0.5-1ml新鲜配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液预固定,用气泡吹打细胞使其混匀。(8)固定:用新鲜配制的3∶2甲冰固定三次,每次30分钟。固定液加入时沿管壁缓慢加入;(9)制片及干燥:用绒毛制片;(10)分带处理。

血管内皮细胞培养

研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便,其法如下:

1、产后新鲜脐带,无菌剪取10—15厘米长一段,如不能立即培养,可于12小时内保存于4℃。

2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血,在入口处用线绳扎紧,以防液体返流。

3、用血管钳夹紧脐带一端,从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶,充满血管,消化3—10分钟;注入口用线绳扎,以防液体返流。

4、吸出含有内皮细胞的消化液,于离心管中,注入温PBS轻轻反复冲洗后,一并注入离心管中(此步骤可重复)。5、离心去上清,加入 RPMI1640培养液制成细胞悬液,接种入培养器皿中,置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

原代软骨细胞分离培养

1、一般根据实验要求,选取不同年龄组的兔子,实际上兔子的年龄越小越好,毕竟幼体组织的活力要高于成体组织的活力,耳静脉空气注射法处死后,无菌条件下分离后肢关节软骨和肋软骨,剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜,放入盛有PBS液的培养皿中。

2、将分离得到的软骨组织剁碎成0.3-0.5mm的组织块,移入25cm2培养瓶,用含双抗的PBS液冲洗软骨3次。

3、加入软骨体积10-15倍的0.25%胰蛋白酶,37℃消化1-2小时后终止消化。

4、加入0.02%II型胶原酶,37℃消化17-20小时(也就是过夜),这是我们实验室长期摸索出来的方法,虽然比较浪费时间,但是获得的细胞活力确实不错。

5、在倒置显微镜下观察,当游离出单个细胞后,加入DMEM培养液将II型胶原酶稀释终止消化。

6、将细胞团吹打成单个细胞后用200目滤网过滤,收集滤液,1500r/min离心5min。

7、弃上清,加入DS培养液重悬,0.2%台盼蓝染色,活细胞率大于90%,CO2培养箱孵育